3-氨基苯硼酸聯合乙二胺四乙酸碳青霉烯酶抑制增強試驗檢測腸桿菌目細菌產碳青霉烯酶的研究

周銀娣，郭 燕張 琴，韓仁如胡付品

腸桿菌目細菌是引起醫院感染最常見的病原菌，產超廣譜β 內酰胺酶和碳青霉烯酶是其對β 內酰胺類抗菌藥物的主要耐藥機制[1]。碳青霉烯類是目前臨床上治療多重耐藥腸桿菌目細菌所致感染最有效的抗菌藥物之一。但隨著該類藥物在臨床上的廣泛應用，碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌（CRE）尤其是耐藥肺炎克雷伯菌（CR-KPN）的檢出率呈快速上升趨勢。由于CRE 菌株往往表現為廣泛耐藥特征，導致其所致感染的高病死率。文獻報道，我國臨床上分離的CRE 菌株產生碳青霉烯酶的種類多，對碳青霉烯類的水解能力亦有較大的差異。由于不同酶抑制劑復合制劑對產不同類型碳青霉烯酶菌株的抑制能力不同，故不同類型碳青霉烯酶菌株感染的臨床治療方案也不盡相同[2]。因此，為應對碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌所致感染帶來的挑戰，喻華等[3]的《腸桿菌目細菌碳青霉烯酶的實驗室檢測和臨床報告規范專家共識》倡議，要求采用一種3-氨基苯硼酸（PBA）聯合乙二胺四乙酸（EDTA）碳青霉烯酶增強試驗對CRE 菌株的產酶機制進行檢測并將檢測結果向臨床報告。為此，復旦大學附屬華山醫院抗生素研究所對已用分子生物學方法明確基因型的部分CRE 菌株采用PBA 聯合EDTA 協同試驗檢測細菌產生的碳青霉烯酶，此方法亦稱碳青霉烯酶抑制劑增強試驗（簡稱PBA-EDTA），并與近年來CLSI 推薦的改良碳青霉烯滅活試驗（mCIM-eCIM 法）[4]對臨床分離的CRE 菌株產生的碳青霉烯酶檢測符合率進行了比較，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 研究的275 株受試菌均為抗生素研究所菌種庫2017—2018 年經PCR 及DNA 測序明確為產碳青霉烯酶的非重復CRE 保存菌株，其相關特性見表1。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705。

表1 經分子生物學檢測的275 株產碳青霉烯酶細菌在腸桿菌目細菌中的分布Table 1 Prevalence of carbapenemase genes in 275 nonduplicate strains of Enterobacterales species by molecular test n（%）

1.1.2 主要試劑和抗菌藥物紙片 美羅培南紙片為英國OXOID 商品，紙片藥物含量為10 μg/片，碳青霉烯酶抑制劑試劑盒購于珠海迪爾生物工程有限公司，內含EDTA 和PBA，每次使用量為10 μL/片，規格為 1 mL/瓶。

1.2 方法

1.2.1 PBA-EDTA 法 按Tsakris 等[5]2010 年 描述的PBA-EDTA 法操作步驟進行：將受試菌調節成0.5 麥氏濁度菌懸液，均勻涂布于紙片法藥敏試驗MH 瓊脂平板上，每個平板貼4 張不同成分的美羅培南紙片，分別為單純美羅培南（MER，細菌耐藥對照）、美羅培南加PBA（10 μL）、美羅培南加EDTA（10 μL）、美羅培南加PBA 加EDTA。見圖1。空氣環境、35℃±2℃孵育16～18 h。判讀標準為：PBA+MER 或EDTA+MER 或PBA+EDTA+MER 的抑菌圈直徑比單藥美羅培南的抑菌圈直徑擴大≥5 mm 者，分別判讀為該受試菌為產A 組碳青霉烯酶或產B 組碳青霉烯酶；同時產A組和B 組復合碳青霉烯酶；如抑菌圈直徑擴大＜5 mm 者，則判斷該菌不產A 組或B 組碳青霉烯酶[6]。此方法中的美羅培南紙片可以用亞胺培南（10 μg/片）紙片替代（摩根菌科細菌除外）。

1.2.2 mCIM-eCIM 法 CLSI 描述[7]mCIM 可以檢測腸桿菌目和銅綠假單胞菌中的碳青霉烯酶，但不能對檢測陽性的菌株進行碳青霉烯酶相關金屬酶和絲氨酸酶的定性，但 mCIM-eCIM 聯合后可以在mCIM 檢測產酶陽性的基礎上結合eCIM 檢測的結果將檢測的酶型進一步檢測分類定性，操作步驟為：準備2 管胰蛋白大豆肉湯（TSB），每管體積2 mL，其中一管加入一張10 μg/片美羅培南紙片和1 μL 接種環一環受試菌懸液，另一管加入一張10 μg/片美羅培南紙片和1 μL 受試菌懸液和20 μL 0.5 mol/L EDTA，空氣環境、35℃±2℃孵育4 h±15 min；將哥倫比亞血瓊脂平板上生長的美羅培南敏感的標準菌株大腸埃希菌ATCC 25922 調節成0.5 麥氏濁度菌懸液，均勻涂布于紙片法藥敏試驗MH 瓊脂平板上，將2 管TSB 中的美羅培南紙片取出貼在MH 瓊脂平板上，CLSI 稱mCIM-eCIM為改良碳青霉烯滅活試驗。根據EDTA 可以抑制MβL（金屬碳青霉烯酶）的原理，如受試菌株產MβL 酶，加入EDTA 抑制劑后可以抑制相應的酶，則可使碳青霉烯類（美羅培南）抑菌圈直徑比未加入EDTA 時擴大，如圖2 所示：如mCIM 檢測結果陽性（抑菌圈直徑在6～15 mm 或在16～18 mm 抑菌圈內存在針尖樣菌落）提示菌株為產碳青霉烯酶菌株；eCIM 結果判讀在mCIM 結果陽性基礎上，如果eCIM 紙片抑菌圈直徑較mCIM 紙片抑菌圈直徑擴大≥5 mm 者，提示菌株產金屬酶；如果抑菌圈直徑擴大＜5 mm 者，提示該菌株產絲氨酸碳青霉烯酶。

1.2.3 統計學分析 采用SPSS 21.0 軟件，分析PBA-EDTA 法和mCIM-eCIM 法檢測CRE 菌株產碳青霉烯酶的能力以及兩種方法與分子生物學檢測的符合率。

2 結果

2.1 PBA-EDTA 法檢測碳青霉烯酶

PBA-EDTA 法對275 株分子生物學方法鑒定為產碳青霉烯酶菌株的檢測陽性率達87.3%（240株），其中，119 株產KPC 型酶的檢出率為99.2%（118 株），對109 株產金屬酶菌株的檢出率為100%（109 株），對13 株產復合酶（KPC/NDM）菌株的檢出率為100%（13 株），但未能檢出分子生物學法檢測并確認的34 株產D 組OXA 酶型的菌株。具體檢測符合率見表2。PBA-EDTA 法檢測結果見圖1。

表2 PBA-EDTA 法對碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌275 株的碳青霉烯酶檢測結果Table 2 Prevalence of carbapenemases in 275 strains of carbapenem-resistant Enterobacterales detected by carbapenemase inhibitor enhancement test using phenylboronic acid（PBA）and EDTA n（%）

2.2 mCIM-eCIM 法檢測碳青霉烯酶

mCIM-eCIM 法檢測產碳青霉烯酶菌株結果見圖2，與已知的分子生物學檢測結果相比，mCIMeCIM 法檢測119 株產KPC 型碳青霉烯酶菌株的陽性符合率為100 %（119 株）；檢測109 株金屬酶的陽性符合率為94.5%（103 株）；檢測D 類酶OXA-232 型的符合率為100%（34 株）；mCIMeCIM 無法有效檢測同時產NDM 和KPC 型碳青霉烯酶菌株。見表3。

2.3 PBA-EDTA 法與mCIM-eCIM 法檢測結果比較

對119 株A 組絲氨酸KPC 酶菌株，PBAEDTA 法與mCIM-eCIM 法檢出率差異無統計學意 義。109 株B 組金屬酶菌株PBA-EDTA 法 與mCIM-eCIM 法檢出率，統計學顯示χ2和P值分別為3.7 和0.06，差異無統計學意義；13 株KPC/NDM 復合酶型的菌株，PBA-EDTA 法能正確檢測出，但 mCIM-eCIM 法均未能正確檢出。反之對OXA-232 型碳青霉烯酶產生株，mCIM-eCIM 法完全檢出而PBA-EDTA 未能檢出。見表4。

3 討論

碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌的發生率正在逐年上升，據CHINET 2020 年報道肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率已經上升到21.5%和22.4%；鮑曼不動桿菌的耐藥率亦已經分別達68.1%和69.0%；而細菌產生的碳青霉烯酶正是細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制[8]。按照Ambler 分類法[9]，此類耐藥酶可以分為3 組：A 組絲氨酸酶，亦稱功能分類2f 組，如最常見的KPC-2、KPC-3 型酶等KPC 酶即為這一組酶；B組金屬β 內酰胺酶（MBL），包括NDM、VIM 和IMP；由腸桿菌目細菌產生的OXA-48 為D 組酶，亦稱功能分類2 d 組，OXA-48 同A 組酶一樣也帶有絲氨酸殘基，此酶有較弱的水解青霉素和碳青霉烯類抗生素的作用，不水解頭孢菌素類，但OXA-48 如果和超廣譜β 內酰胺酶（ESBL）、膜孔蛋白缺失協同作用將導致對碳青霉烯類藥物的高水平耐藥。由于碳青霉烯酶的產生，可直接導致該類耐藥菌株所致感染瀕于無藥可用。因此臨床微生物實驗室如能對耐藥菌賦予兼有耐藥機制的藥敏試驗報告，將有助于臨床合理用藥，降低病死率，提高治愈率。文獻報道，實驗室如延遲對耐藥菌株諸如產碳青霉烯酶型的診斷報告，將導致患者死亡率上升[10]，因此快速、準確的碳青霉烯酶型的診斷十分重要。

目前關于碳青霉烯酶表型檢測方法，CLSI、商品化的檢測試劑以及文獻均有許多相關報道和推薦，大都已為臨床應用，但因使用過程中產生的各種弊端，故使用并不廣泛。如2015 年CLSI推薦的一種碳青霉烯酶表型快速檢測方法Carpa NP 試驗，由于每次試驗需要配制新鮮試劑[11]、且配制過程較為麻煩，還常會出現無效的檢測結果。CLSI 2017 年推薦的mCIM 法僅適用于腸桿菌目細菌和銅綠假單胞菌中的碳青霉烯酶，雖然2018 年又推薦mCIM 聯合eCIM 法可同時檢測和區分腸桿菌目細菌產生的金屬和絲氨酸碳青霉烯酶，但操作費時費力[12]。商品化的酶免疫層析技術可同時檢測KPC、NDM、OXA-48、VIM 和IMP 等多種碳青霉烯酶，但價格昂貴[13]。近年來新出現的MLADI-TOF MS 涉及CRE 的研究較少，且沒有統一標準[14]。PCR 是檢測碳青霉烯酶的金標準，但目前在基層微生物室普及開展[15]尚有一定困難。

本組資料對275 株已知產碳青霉烯酶基因型的耐藥腸桿菌目細菌，采用PBA-EDTA 法檢測這些菌株中的碳青霉烯酶及其酶型分類，欲獲取與原分子生物學方法檢出結果的符合率，以便在臨床上推廣。此法的原理是利用PBA 抑制A 組絲氨酸碳青霉烯酶，EDTA 抑制B 組金屬β 內酰胺酶，兩者聯合亦可同時檢測和區分腸桿菌目細菌產生的A 組絲氨酸碳青霉烯酶和B 組金屬β 內酰胺酶。結果顯示PBA-EDTA 聯合檢測275 株碳青霉烯類耐藥菌株的碳青霉烯酶型譜與原菌種分子生物學鑒定的碳青霉烯酶型譜大致相仿，檢測出的產KPC、MβL 和KPC+MβL 復合酶的各種酶型的符合率分別為99.2%、100%和100%。采用mCIM-eCIM 法對275 株細菌的檢出結果與分子生物學鑒定的結果符合率略高于PBA-EDTA 法相應的檢出率，而對MβL 的檢出率略低于PBA-EDTA法相應的檢出率，分別為100%和94.5%。雖然有1 株細菌用PBA-EDTA 法未能檢出，而mCIMeCIM 法可檢測出分子生物學檢測出的KPC 酶的結果（分子生物學檢測分型），但經統計學分析，兩者檢出結果與分子生物學檢出結果的符合率差異無統計學意義。此外mCIM-eCIM 法未能檢測出產KPC+MβL 復合酶菌株，截然不同于能100%檢測出產復合酶菌株的PBA-EDTA 法。同樣另有34株產D 組blaOXA-232碳青霉烯酶菌株（分子生物學檢測分型）可100%（34/34）經mCIM-eCIM 法順利地檢出，但PBA-EDTA 法卻未能檢出。mCIMeCIM 法原理是在mCIM 檢測結果為陽性的基礎上，表示耐藥菌株產生碳青霉烯酶，但不能分類酶型；如果此時eCIM 法結果亦為陽性，則意味耐藥細菌為產B 組金屬酶的菌株，如為陰性結果則可判別這株細菌為產絲氨酸酶型菌株。應該說明的是本組資料中這34 株分子生物學檢測為D 組blaOXA-232酶，雖然mCIM-eCIM 法檢出為產酶菌株，但無法將A 組和D 組絲氨酸酶型分類，也就無法明確是產KPC 或OXA 酶，僅是明確為絲氨酸酶產生株。也提示本組資料采用的PBA-EDTA 法雖然不能檢測出34 株D 組OXA 酶，但是能檢測出分子生物學檢測和確認的189 株A 組（2f 組）絲氨酸酶即KPC 酶。

van Dijk 等[16]以及Pournaras 等[6]分別對128株以及189 株臨床分離非重復腸桿菌目細菌檢測細菌產碳青霉烯酶，亦采用PBA-EDTA 法，并與分子生物學法比較。van Dijk 等[16]采用分子生物學方法檢測產KPC 和金屬酶的菌株分別為37 株和31 株，PBA-EDTA 法檢測出35 株 和28 株；Pournaras 等[6]采用分子生物學方法檢測KPC 和金屬酶分別為60 株和9 株，PBA-EDTA 法檢測出57株和9 株。本研究的符合率與上述文獻報道大致相仿。但需要注意的是，PBA-EDTA 法不適用于對除腸桿菌目細菌外的碳青霉烯酶耐藥機制的檢測。由于銅綠假單胞菌等其他不發酵糖革蘭陰性菌的耐藥機制較為復雜，如銅綠假單胞菌天然產生染色體介導的AmpC 酶，而PBA-EDTA 檢測法中的PBA 可抑制AmpC 酶的活性，可能將導致碳青霉烯酶檢測結果呈假陰性。此外，mCIM-eCIM法可用于銅綠假單胞菌碳青霉烯酶的檢測。

總體而言，PBA-EDTA 法適宜檢測腸桿菌目細菌產生的A 組絲氨酸碳青霉烯酶、B 組金屬酶以及同時產A 組和B 組碳青霉烯酶的菌株；操作較mCIM-eCIM 法簡單易行，不需要對受試菌株進行繁瑣的預處理，結果易讀；便于臨床微生物實驗室使用和開展腸桿菌目細菌產生的A 組絲氨酸碳青霉烯酶和B 組金屬酶，對未能檢測酶型的為數不多的碳青霉烯類耐藥菌株可繼續開展分子生物學方法檢測D 組OXA 碳青霉烯酶，為臨床合理使用抗菌藥物精準治療提供實驗室依據。