利奈唑胺耐藥腸球菌感染危險因素及耐藥機制分析

夏 晴，呂 梅，李慶蓉，和平安，李 江，楊 旭

腸球菌為兼性厭氧的革蘭陽性球菌，廣泛分布于人和動物消化道內和自然環境中，是人體正常菌群之一，同時也是一種條件致病菌。近年來，由于臨床上抗生素的廣泛使用及侵襲性操作的普及，腸球菌已成為醫院感染的主要病原菌之一。腸球菌對多種抗生素天然耐藥，并可通過接受外來的耐藥質粒、轉座子或通過基因突變獲得耐藥性[1]，給預防治療帶來了巨大挑戰。

1 材料與方法

1.1 資料來源

1.1.1 研究對象 收集2018 年9 月—2020 年12月昆明醫科大學第二附屬醫院分離的非重復腸球菌標本2 898 份，其中LRE 陽性標本38 份。根據LRE 感染來源分為醫院獲得性（HA-LRE）組和社區獲得性（CA-LRE）組，同時在盡可能相同標本和科室中按照1∶4 的比例隨機抽取利奈唑胺敏感腸球菌（LSE）感染者標本作為對照組。

腸球菌分離自患者無菌部位血液、體液標本，胸腔和腹腔保留積液標本，中段尿標本。分離的菌株吸附在濾紙上而后冷凍干燥保存于－80 ℃。

不同感染部位診斷[3]：①尿路感染，出現尿頻、尿急、尿痛等尿路刺激癥狀，或有下腹觸痛、腎區叩痛，伴或不伴發熱，清潔中段尿培養腸球菌菌數≥104CFU/mL；②腹腔感染，引流液培養陽性和新的或加重的腹膜炎癥狀如腹部壓痛和反跳痛，腹水量增加或性質改變；③燒傷后傷口感染，傷口愈合不良，切口周圍出現紅腫、發熱和疼痛，滲出物明顯增多，創面分泌物或膿液培養陽性；④血流感染為急性發熱，白細胞及中性粒細胞明顯增高，而無局限于某一系統的急性感染，出現皮疹、肝脾腫大、遷徙性膿腫等癥狀，血培養陽性。

1.1.2 病例資料收集 收集臨床基本信息包括人口學特征（性別、年齡），住院特征（外院轉入、住院科室、ICU 入住情況），基礎疾病（高血壓、糖尿病、泌尿系統疾病），免疫狀態（低蛋白血癥、腫瘤），侵襲性操作（近6 個月手術史、氣管插管、導尿管），近6 個月抗菌藥物使用史（碳青霉烯類、利奈唑胺），多數菌感染（同一患者有2 個或更多種細菌或真菌感染）。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定及藥敏試驗 分離的LRE 采用紙片擴散法（K-B 法）進行驗證，根據臨床和實驗室標準化協會（CLSI）M100-S30 的標準，最低抑菌濃度（MIC）≥8 mg/L 為耐藥。通過在VITEK 2-Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統（法國生物梅里埃公司）上使用AST-GP67 卡對分離株進行藥物敏感性試驗。

1.2.2 利奈唑胺耐藥基因檢測 復蘇LRE 菌株，提取基因組 DNA 及質粒 DNA，采用PCR 技術分別擴增23S rRNA V 區基因、編碼核糖體蛋白的L3、L4 基因及cfr、optrA和poxtA基因。陽性擴增產物送至北京擎科生物科技公司進行雙向測序。與標準菌株糞腸球菌ATCC 29212 進行比對，確認腸球菌是否存在基因突變及耐藥基因。

1.2.3 統計學方法 使用SPSS 26.0 統計軟件進行數據分析。計量資料通過t檢驗（正態分布變量）或秩和檢驗（非正態分布變量）進行單因素分析，計數資料通過卡方檢驗或Fisher 精確概率法進行單因素分析，計算相關統計量用百分比（%）表示。單因素分析中P＜0.1 的變量納入logistic 回歸模型中，用于評估LRE 感染的獨立危險因素。優勢比（OR）和95%置信區間（CI）以評估關聯的強度。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征

從38 例LRE 感染患者檢出38 株LRE，排除資料不完整5 例，共納入33 例LRE 感染患者。16例為醫院獲得性LRE 感染組，64 例醫院獲得性LSE 感染為對照組；17 例為社區獲得性LRE 感染組，68 例社區獲得性LSE 感染為對照組。38 株LRE 菌株主要來源為中段尿（20 例，52.6%），引流液（11 例，28.9%）。見圖1。科室主要分布在泌尿外科（17 例，44.7%）。見圖2。

2.2 藥敏試驗

所有LRE菌株利奈唑胺的MIC值為8～16 mg/L，呈低水平耐藥。利奈唑胺耐藥屎腸球菌（LREfm，6 株）對環丙沙星、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、米諾環素、四環素均耐藥，對萬古霉素、替考拉寧和替加環素均敏感。利奈唑胺耐藥糞腸球菌（LREfs，32 株）對克林霉素、奎奴普丁-達福普汀均耐藥，對紅霉素、四環素耐藥率為90%以上，對替加環素100%敏感，有3 株對萬古霉素耐藥。多重耐藥被定義為對3 種及以上抗菌藥物不敏感，本研究中所有LRE菌株均為多重耐藥。見表1。

表1 利奈唑胺耐藥腸球菌對17 種抗菌藥物的藥敏試驗Table 1 Susceptibility of linezolid-resistant Enterococcus to 17 antibiotics[n（%）]

2.3 耐藥機制

HA-LRE 和CA-LRE 菌株主要耐藥機制都是攜帶optrA基因，均未發現23S rRNA V 區突變和獲得poxtA基因存在。有2 株LRE 菌株均未檢測到23S rRNA V 區，核糖體蛋白L3、L4 基因突變和攜帶cfr、optrA和poxtA基因，是否存在其他耐藥機制，有待進一步研究。見圖3。

2.4 HA-LRE 感染危險因素分析

2.4.1 單因素分析 單因素分析結果顯示，入住ICU、氣管插管、膀胱沖洗是HA-LRE 感染主要的危險因素（P均＜0.05）。見表2。

表2 醫院獲得性利奈唑胺耐藥腸球菌感染危險因素的單因素分析Table 2 Univariate analysis of risk factors for hospital-acquired LRE infection

表2（續）Table 2（continued）

2.4.2 多因素分析 對單因素分析中P＜0.1 的變量進行多變量logistic 回歸分析發現氣管插管（OR4.913，95%CI：1.119～21.571，P=0.035）是HALRE 感染的獨立危險因素。logistic 回歸模型的Hosmer Lemeshow 檢驗表明數據擬合良好（χ2=8.595，df=7，P=0.283）。

2.5 CA-LRE 感染危險因素分析

2.5.1 單因素分析 單因素分析結果顯示，低蛋白血癥、復數菌感染是CA-LRE 感染主要的危險因素（P均＜0.05）。見表3。

表3 社區獲得性利奈唑胺耐藥腸球菌感染危險因素的單因素分析Table 3 Univariate analysis of risk factors for community-acquired LRE infection

2.5.2 多因素分析 對單因素分析中P＜0.1 的變量進行多變量logistic 回歸分析發現低蛋白血癥（OR10.166，95%CI：1.378～74.972，P=0.023）、復數菌感染（OR5.773，95%CI：1.198～27.828，P=0.029）是CA-LRE 感染的獨立危險因素。logistic 回歸模型的Hosmer Lemeshow 檢驗表明數據擬合良好（χ2=0.39，df=1，P=0.532）。

3 討論

利奈唑胺是治療由多重耐藥革蘭陽性細菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬古霉素腸球菌（VRE）引起嚴重感染的重要藥物。在中國，2007 年將利奈唑胺引入臨床實踐后不久就出現了耐利奈唑胺的分離株[4]。近期研究顯示，在幾個監測項目中，腸球菌分離株對利奈唑胺耐藥率較低（＜2%）[5]。但是，一旦出現高耐藥率，臨床治療就會出現問題，因此應該引起足夠關注。本研究中，CA-LRE 感染占57.9%，表明社區感染不可忽視。我院分離的LRE 菌株主要來自泌尿外科，標本類型主要為中段尿，可能原因為泌尿系統疾病（腎結石、輸尿管狹窄、前列腺增生、腫瘤等）引起排尿不暢，尿液潴留，增加了耐藥菌繁殖，以及泌尿道相關侵襲性操作，導致防御功能減弱，增加了耐藥菌感染的機會[6]。

本研究的38 株LRE 菌株對利奈唑胺呈低水平耐藥性，MIC 值為8～16 mg/L。LREfs 對克林霉素、奎奴普丁-達福普汀均耐藥，對紅霉素、四環素耐藥率為90%以上，與姚丹等[7]的研究相一致；與全國耐藥監測數據相比[8]，我院LREfs 菌株對左氧氟沙星和慶大霉素的耐藥率明顯增高，可能與這些抗菌藥物普遍使用有關；其中有3 株對萬古霉素耐藥，對替加環素都敏感。LREfm 對環丙沙星、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、米諾環素、四環素均有高的耐藥率，LREfm 整體耐藥水平高于LREfs。耐藥性的差異提示臨床應根據細菌種類、耐藥率的變化合理選擇治療方案。

目前已明確的腸球菌對利奈唑胺耐藥機制主要有5 種，包括23S rRNA V 區突變，L3、L4 核糖體蛋白突變，攜帶poxtA基因，多重耐藥基因cfr介導的耐藥以及近年來研究逐漸增多的optrA基因[9]。各國對腸球菌利奈唑胺耐藥機制的報道越來越多，但主要耐藥機制不同。在本研究中，可轉移耐藥基因optrA是對利奈唑胺耐藥的主要機制，攜帶optrA基因菌株的高發率與韓國的先前研究相似[10]。愛爾蘭研究表明[11]，poxtA基因有較高流行。美國多中心研究發現利奈唑胺的主要耐藥機制是23S rRNA 中的G2576T 突變[12]。然而我院未發現LRE 菌株攜帶poxtA基因和23S rRNA突變。表明主要耐藥機制存在地域差異。

HA-LRE 感染危險因素中，氣管插管是獨立危險因素，與Ma 等[13]研究相一致。可能原因有：①氣管插管的患者住院時間長，醫院環境中可能存在LRE 定植，通過醫源性感染、交叉感染等途徑將其傳播至患者；②患者免疫功能低下，同時伴有嚴重的基礎疾病更易獲得LRE 感染；③患者同時伴有更多部位的侵襲性操作容易破壞皮膚和黏膜的屏障，損害宿主的防御系統，并把LRE 帶入機體引起感染。文獻報道男性、入住ICU、腸道灌洗、外院轉入、腫瘤等可能是LRE 感染的危險因素，不同的研究結果之間存在差異。本研究除氣管插管外未發現其他危險因素，可能原因是樣本量少。一些研究表明腸球菌對利奈唑胺耐藥性與利奈唑胺長期暴露有關[14]，但是也有從未接觸過利奈唑胺的患者體內分離出利奈唑胺耐藥腸球菌[15]。我院HA-LRE 感染患者住院期間均無利奈唑胺用藥史，可能的解釋是先前的暴露或者院外曾經使用但病史未記錄等。

在CA-LRE 感染危險因素中，復數菌感染、低蛋白血癥是獨立危險因素。值得注意的是，腸球菌和大腸埃希菌的綴合實驗確定了革蘭陽性菌和革蘭陰性菌之間利奈唑胺耐藥基因的可轉移性[16]。本研究發現復數菌感染是獨立危險因素，可能原因是在腸球菌分離物中檢測到的optrA基因可能是從臨床中的其他細菌（如大腸埃希菌）轉移而來的。通常低蛋白血癥患者免疫功能降低，容易受到外來細菌的侵襲，耐藥細菌間的水平傳播也更易在該環境下進行。CA-LRE 耐藥機制檢測以optrA基因（78.9%）為主。有文獻報道，optrA基因在動物來源腸球菌中檢出率可能更高，動物源的腸球菌可能作為耐藥基因的貯存庫，成為社區內腸球菌optrA基因的潛在來源[17]。有研究表明，腸球菌對利奈唑胺耐藥很可能通過耐藥基因的克隆擴增或水平轉移在社區環境中傳播，然而社區環境中大多數病例與醫療相關，因此主要以醫療保健相關的方式傳播[18]。CA-LRE 感染的增加需要考慮動物-環境-人的傳播途徑，動物和食物可能成為潛在的危險因素，需要加強食品安全管理。

綜上所述，本研究發現HA-LRE 和CA-LRE感染的危險因素有所不同，因此醫務人員應該意識到有這些危險因素的患者中存在LRE 感染的可能，并采取適當抗感染措施。在社區環境中optrA基因介導的LRE 的出現令人震驚，應該引起高度重視。

本研究存在一些局限性。首先，研究的LRE分離株的數量相對較少；其次，這是一項單中心研究。需要進一步的多中心研究來確認LRE 感染危險因素及其主要耐藥機制。