黃曲霉毒素B1脫毒技術的研究進展

孔令露，梁 幸，沈賀彬

(福建師范大學生命科學學院， 福建 福州 350117)

民以食為天，食以安全為先，食品安全與社會穩定及人類的健康密切相關。據聯合國糧食與農業組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)數據顯示，全球約有25%糧食農作物受到真菌毒素的污染[1]。真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌產生的天然次級代謝產物，世界衛生組織( World Health Organization, WHO) 將其對食品與飼料造成的污染列為食源性疾病的重要根源[2]。黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)主要是由黃曲霉Aspergillusflavus、寄生曲霉Aspergillusparasiticus和諾氏曲霉Aspergillusnomius等真菌產生的有害毒素[3]。已鑒定的黃曲霉毒素種類有20多種，常見的主要有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1等，且毒性從大到小依次是：AFB1>AFM1>AFG1>AFB2>AFG2，其中黃曲霉毒素B1( Aflatoxin B1, AFB1)作為毒性最強的生物毒素，毒性約為氰化鉀(KCN)的10倍和砒霜(As2O3)的68倍[4]，可在人或動物體內蓄積，具有致畸、致癌、致突變等作用，1993年被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer, IARC)定為I級致癌物質，目前是人們公認天然毒性最強的化合物之一[5]。AFB1污染給人類健康和經濟發展造成了巨大的威脅，如何降低食品中黃曲霉毒素B1的含量，減少其帶來的危害成為當下食品安全的一大難題。目前主要的脫毒方法包括物理、化學以及生物法，不同的脫毒方法各有其優缺點，本文將對3種主要的脫毒手段和優缺點加以概述，旨在為今后更好地認識和去除AFB1提供理論參考。

1 AFB1毒性位點分析

AFB1作為劇毒化合物，是由1個雙呋喃環和1個氧雜萘鄰酮組成的香豆素衍生物，其含有3個毒性位點(圖1)，毒性位點1位于雙呋喃環上的第8、9雙鍵上，且是AFB1高毒性的關鍵[6]，該位點主要是與DNA/RNA和蛋白質共價結合形成加合物，從而影響細胞的代謝，同時也是導致基因突變的主要功能基團；毒性位點2位于香豆素內酯環上的10、11、15位點，該位點易發生水解反應生成含雙呋環結構的AFD1；毒性位點3位于環戊烯酮環上的1、2、3、14位點上，該位點容易被取代基所取代，如發生酮羰基還原、加成作用等反應來改變AFB1的毒性。因此，破壞3個相應的毒性位點成為了AFB1減毒、脫毒的重要關鍵。

圖1 黃曲霉毒素B1的結構Fig.1 Structures of Aflatoxin B1

2 AFB1污染情況分析

黃曲霉毒素B1的污染是一個全球性的問題，AFB1引起的食品污染問題時常發生，根據過去10年全球污染率的數據統計，AFB1污染最高濃度達1 642 μg·kg-1，其中水稻污染率位居第3，平均有55.4%的水稻樣本被AFB1污染[7-8]。Bansal等[9]對加拿大199份水稻樣本進行檢測，其中56份樣本呈現AFB1陽性，濃度達7.1 μg·kg-1。此外，飼料和部分農產品也常受到AFB1的污染，被污染的飼料和農產品通過食物鏈的傳遞將導致AFB1在人體內直接或間接的蓄積。目前已超過百種農產品和食品檢測出受到AFB1的污染，尤其是在氣候濕熱的地區，部分熱帶和亞熱帶地區AFB1的污染情況見表1。

表1 部分熱帶和亞熱帶地區食品和飼料樣品中AFB1的污染Table 1 AFB1 contamination in the food and feed samples from some tropical and subtropical zones

3 AFB1脫毒方法的比較

考慮到食品安全問題，許多國家和地區規定了食品和飼料中AFB1含量的限量標準，國際上歐盟規定AF的限量標準范圍為4～15 μg·kg-1，AFB1的允許范圍為0.1～12 μg·kg-1，美國食品和藥品管理局將AFB1在食品中的最高限量標準設定為20 μg·kg-1[18]。各組織及國家關于食品中AFB1的限量標準見表2[18-19]。

表2 各組織及國家食品中對黃曲霉毒素B1的限量Table 2 Limits of Aflatoxin B1 in the foods from various organizations and countries

目前去除AFB1的方法主要包括物理、化學和生物法，各脫毒方法各有其優缺點，表3列出了AFB1常用的脫毒方法的比較。

表3 AFB1脫毒方法的比較Table 3 Comparison of AFB1 detoxification methods

3.1 物理脫毒

3.1.1吸附 吸附脫毒主要利用吸附劑吸附毒素來減少飼料以及農副產品中毒素的含量，從而達到減毒效果，但不能降低毒素，無法徹底解決毒素污染問題。傳統的吸附劑包括硅膠、黏土、沸石、氧化鋁等，新型的吸附劑包括纖維素、殼聚糖及硅鋁酸鹽類等有機物。近年來，經過不斷的探索，納米技術已應用于吸附劑，如磁性吸附劑，其吸附容量和材料穩定性已遠遠提高[36]。Pirouz等[37]利用磁性氧化石墨烯納米復合材料(MGO)的吸附作用來減少鐮刀屬真菌毒素的污染。對于新材料和新技術的探索在不斷增加，Scaglion等[20]采用22中心復合旋轉設計，提出了使用稻殼作為吸附劑來去除AFB1，用0.5 g大小為42目的稻殼吸附10 mL被黃曲霉毒素B1和M1污染的牛奶，平均吸附量約為0.0150 μg·g-1AFB1和0.0174 μg·g-1AFM1，且吸附劑基本能達到100%回收率。吸附劑雖成本低，且能重復利用，但因其特殊的選擇性、可逆性以及不穩定性，且反復洗脫可以使毒素游離出來，很少在工業化上應用。

3.1.2輻射 輻射脫毒主要是利用紫外線、X射線、γ射線以及微波等手段殺滅微生物或破壞其產生的毒素分子結構，從而減弱其毒性。最為常見的方法是紫外線輻射，通過破壞真菌的蛋白質和核酸結構，使其在代謝過程中發生紊亂，從而抑制產毒真菌的生長[38]，從根源上減少毒素的污染。Gillani等[17]先后用輻射、日照以及紫外線復合處理被真菌毒素污染的玉米，去除率幾乎達到100%。紫外線輻照對真菌毒素的去除效果良好，且幾乎不會破壞食品中的品質，在食品行業中具有廣闊的應用前景。

γ射線是比較常見的輻射脫毒方法，Ferreira-Castro等[39]用5 kGy劑量的γ射線能夠有效地抑制鐮刀屬真菌的生長，掃描電鏡結果顯示菌絲體受到輻射損傷，當輻照劑量增加到10 kGy時，鐮刀菌毒素完全被降解。Chanem等[21]研究了γ 射線對食品和飼料中AFB1的影響，數據顯示，輻照劑量為10 kGy的γ射線對玉米、大麥中AFB1的去除率分別為84.23%和89.86%。Wang等[40]用Co60γ射線處理含20 μg·L-1AFB1的甲醇水溶液(60∶40，V甲醇∶V水)，用高效液相色譜-四極桿飛行時間光譜儀獲得20多種放射性產物的分子量和分子式，且提出了7種關鍵的放射性產物的可能形成途徑。γ射線雖脫毒效率高且能實現工業化應用，但高劑量的輻射可能會破壞食品質感，同時存在一定的安全隱患，因此，其對處理過程環境要求十分嚴格。

3.1.3熱處理 熱處理脫毒主要是通過高溫破壞真菌毒素的分子結構，達到減毒的目的。利用高溫脫毒是早期最常用的手段之一，其主要包括干燥、蒸煮、烘烤等。AFB1耐受溫度高于235℃，對高溫具有很強的抵抗力，因此簡單的加熱不能夠完全去除，然而延長加熱時間似乎能提高其去除率，如被AFB1污染的花生粕進行焙烤30 min，對AFB1的去除率可達到40%～60%[22]；Lee等[23]用100℃和150℃處理被AFB1污染的大豆90 min，去除率分別為41.9%和81.2%，由此可見熱處理去除毒素的效率與溫度、加熱時間息息相關，同時毒素濃度和樣品含水量可能也會影響脫毒的效果。熱處理操作簡便，但高溫伴隨大量的熱量消耗，增加成本的投入，不適于工業化的應用，同時高溫也會影響食品的品質和口感，因此食品工業可能會將研究方向轉移到非熱處理技術上。

3.2 化學脫毒

化學法脫毒主要是利用添加的化學試劑修飾或破壞毒素的分子結構從而達到脫毒，如O3、酸堿、氨氣等對真菌毒素有一定的破壞作用；同時化學脫毒法存在一定的缺陷，會導致化學物質的二次污染，殘留的化學物質可能直接威脅人們的健康。

3.2.1臭氧 O3作為強氧化劑，在水溶液中有極強的氧化分解能力。Luo等[41]研究表明O3能夠破壞AFB1終端的呋喃環雙鍵，進而降低化合物的毒性，主要是通過-CH3、-OH、-CO等基團的丟失來脫毒。Mohammadi等[25]利用臭氧來降解牛奶中的AFM1，結果顯示，O3處理5 min能去除牛奶中50%AFM1，處理時間越長，去除效果越好，牛奶中的微生物總量和β-胡蘿卜素含量顯著下降，但pH和氧化水平沒有明顯變化，該文首次報道了臭氧處理牛奶中的AFM1污染問題。O3脫毒法操作簡單，且無毒物殘留，適用于食品脫毒，但其強氧化性破壞食品中的蛋白質和維生素等成分，該方法不適用于對營養價值要求較高的食品脫毒。

3.2.2堿處理 在堿性條件下，AFB1的內酯環結構十分不穩定，易發生水解，生成水溶性的無毒鈉鹽，AFB1結構發生改變從而達到減毒的目的。張春華等[26]將受AFB1污染的花生原料浸泡在pH為8～9的堿性溶液中，AFB1的去除率可到達56.73%。同時楊威等[27]也報道用pH為13.40的堿液浸泡四級花生15 min，壓榨花生油中AFB1的脫毒效果達93.3%。除此之外，氨氣也可以降低其毒性，氨氣通過與AFB1發生脫-OH反應，破壞其環狀結構，達到解毒目的。氨氣來源廣泛且能回收利用，具有較大的開發潛力。堿處理脫毒效率高，但堿容易與食品中的化學物質發生反應，在一定程度上會影響食品的口感和品質。

3.2.3天然產物 天然產物是一類由動物、植物、以及微生物產生的次級代謝產物，具有廣泛的來源，因此在農業、食品、醫藥方面得到廣泛的應用。近年，利用天然代謝產物來降解生物毒素的研究方向逐漸成為人們的聚焦點。

Anjum等[42]研究了薄荷葉及芽的水提取物對AFB1和AFB2的去除情況，葉提取物對AFB1(100 μg·L-1)和AFB2(50 μg·L-1)的降解率分別為75%、80%；芽提取物對其的降解率僅為40%～48%，通過LCMS/MS分析得到7種AFB1的降解產物，同時MS/MS光譜顯示大多數產物是由苯環側鏈甲氧基的丟失、呋喃環末端雙鍵的去除和內酯基團的修飾形成，且降解產物對海水蝦表現出更低的毒性。Iram等[28]探究檸檬桉水提物對黃曲霉家族B1和B2的降解作用，在pH為8，30℃孵育72 h脫毒率分別為95.21%和92.95%。隨后研究了決明子葉水提取物對AFB1和AFB2的降解率分別為90.4%和88.6%[29]，通過MS/MS譜圖顯示降解產物主要通過末端呋喃環雙鍵的去除以及內酯環的修飾形成。總而言之，天然產物的開發為真菌毒素降解的研究灌入了一個全新的思維。

3.3 生物脫毒

生物法脫毒是目前AFB1脫毒的研究熱點，其機制主要是利用細胞吸附、生物轉化以及分泌生物酶來減少毒素含量。目前報道能降解AFB1的微生物包括枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、乳酸桿菌Lactobacillusplantarum、嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia、嗜鹽念珠球菌Tetragenococcushalophilus、黑曲霉Aspergillusniger和平菇Pleurotusostreatus等。大多數降解菌株以香豆素作為唯一碳源篩選得到。部分微生物對AFB1的降解情況見表4。

表4 降解AFB1的部分微生物Table 4 Microorganisms partially degrading AFB1

3.3.1生物吸附 有研究表明微生物吸附去除AFB1主要是通過以非共價的方式形成菌體-AFB1復合物，從而來減少毒素的污染。目前，普遍認為微生物吸附主要是與細胞壁中的肽聚糖及多糖分布有關。Li等[30]研究嗜鹽酵母菌CGMCC 3790(salt tolerantCandidaversatilisCGMCC 3790)對AFB1的降解機理和動力學，數據顯示菌體與20 ng·mL-1AFB1孵育1 h，對AFB1的吸附效率達69.40%。Li等[48]研究報道嗜鹽念珠球菌CGMCC 3792(salt tolerantTetragenococcushalophilusCGMCC 3792)通過生物吸附作用1 h可去除54.25% 的AFB1(20 ng·mL-1)。同時Kosztik等[31]研究乳酸桿菌對AFB1和雜色曲霉素(sterigmatocystin，ST)的吸附能力，其中乳酸桿菌Lactobacillus.PentosusTV3 10 min能吸附11.5% AFB1，但對ST吸附率卻高于20%，同一菌株對不同毒素的結合潛力存在明顯的差異，保守的肽聚糖結構可能是導致差異的關鍵原因。微生物吸附作用綠色安全，對毒素的去除具有一定的應用前景。

3.3.2生物降解 1967年，Lillehoj等[52]首次報道橙色黃桿菌Flavobacteriumaurantiacum能夠降解黃曲霉毒素B1。多數微生物都是酶促生物轉化，通過溫和綠色環保的方法降低食品中的AFB1濃度。Xu 等[32]從43株細菌中分離篩選得到1株對AFB1降解效率高達92.1% 的沙克氏桿菌 L7(BacillusshackletoniiL7)，并從代謝產物中分離出分子量為22 kDa的胞外酶，該酶在70℃，pH為8.0表現出較高的活性。Wang 等[33]從白腐真菌YK-624(white-rot fungusPhanerochaetesordidaYK-624)中提取到錳過氧化物酶(MnP)，研究表明該酶能夠有效地降解AFB1，推測其降解機制：AFB1首先被MnP氧化成AFBO，隨后再水解成低毒的AFB1-8，9-二氫二醇，目前未見報道該酶的相關酶學常數Km及Kcat。Eshell等[53]報道在30℃，pH值為6.0的條件下紅曲霉與AFB1孵育24 h后，對AFB1的去除效率達到95.9%，同時通過HR-FTMS分析測試表明，AFB1的降解與脂肪酸代謝和糖酵解中間產物的積累有關，并從紅曲霉中鑒定出許多關于芳香族化合物的分解代謝途徑相關的酶。

3.4 其他脫毒技術

光催化作用已成功用于污水和有機物污染物的降解，其中二氧化鈦(TiO2)在光催化降解有機污染物方面具有很大的潛力，但可見光響應差，光生電子-空穴對分離效率低，限制了其廣泛的應用。科技在不斷地進步，Zhang等[35]通過原位溶劑熱法成功制備了TiO2/UiO-67光催化劑，80 min對AFB1的降解率為98.9%，效果優于市售的P25、TiO2和大多數可見光照射下報道的光催化劑。光催化為環境中有機污染物的降解提供一個有效的策略。

4 展望

目前，關于AFB1的降解手段呈現多樣化，但隨著生物科技的發展，生物法脫毒因其高效安全、綠色環保的特點，將成為未來真菌毒素脫毒手段的聚焦點。因此，未來生物脫毒可朝著以下3個方向延伸：(1)抑制產毒真菌的生長；從根源上減少生物毒素的污染；(2)對生物毒素的生物合成途徑進行調控，抑制產毒基因的表達；(3)人工過表達具有降解作用的生物酶。隨著降解酶逐漸被發現和研究，降解條件和效果也在不斷優化，真菌毒素的研究將會有巨大的發展空間。此外，隨著合成生物學技術的成熟和基因編輯技術的發展，研究者們構建出能夠表達高附營養價值的細胞工廠(如降解酶、藥物蛋白以及生物化學品等)；在食品、藥物和環境保護等方面具有巨大的發展潛力，同時可通過基因編輯技術建立降解真菌毒素的專屬“細胞工廠”。

此外，關于真菌毒素的生物脫毒仍存在三方面問題：(1)難以篩選到具有高效降解作用的菌株，且實現工業化應用面臨巨大的挑戰；(2)生物脫毒技術不夠完善，對生物酶和活性分子的分離純化技術欠缺；(3)降解機制和降解產物的種類及其安全性研究較少。通過解決以上3個方面的問題，生物法降解AFB1才能有望在農業生產中得到應用。