1種細菌纖維素基抗菌復合材料的制備及性能評價

林偉鈴，胡 丹，朱宏陽，林 勇，王金海

(福建衛生職業技術學院藥學院， 福建 福州 350101)

纖維素存在于植物細胞壁中，是自然界中能夠找到的最豐富的聚合材料之一[1]。目前，工業所需的纖維素主要來源是木材[2]，生產過程涉及森林的砍伐并且會造成環境污染[3-4]。與植物纖維素相比，由多種微生物產生的細菌纖維素(Bacterial Cellulose, BC) 不含半纖維素和木質素等雜質，是最純的纖維素形式之一[5]。BC具有高安全性、低成本、高柔韌性和適應性、親水性、透明性、生物相容性和生物可降解性等優異的物理化學性質[6]。BC在食品、醫療、化妝品、造紙及聲學器材等領域工業中有著廣泛的應用，特別是在食品方面除了作為食品添加劑，還可作為環保型食品外包裝材料[7-11]。 BC可與抗菌劑制備獲得抗菌材料，此類復合抗菌材料具備生物可降解性，還能夠較好地抑制微生物的生長，可用作醫用抗菌敷料，也可用作抗菌食品包裝材料。目前，在抗菌食品包裝材料上BC抗菌復合材料的研究主要集中于月桂酸/BC、姜黃素/BC、殼聚糖/BC等[12-14]。

ε-聚賴氨酸(ε-Polylysine,ε-PL)是由25～35個L-賴氨酸殘基組成的生物聚合物，可被機體完全消化為賴氨酸[15]。ε-PL具有廣譜抗菌能力，同時具備生物降解性、低毒性和低成本等特點，可應用于果蔬保鮮、食品防腐以及農業生產上植物病害的防治等領域[16-18]。本課題將ε-PL與細菌纖維素復合制備新型抗菌敷料PLBC復合膜，并對PLBC復合膜進行性能評價和抑菌性能考察，為今后PLBC復合膜在抗菌敷料及抗菌食品包裝領域的應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

細菌纖維素由本課題組制備獲得，ε-聚賴氨酸由南京工業大學提供，菌種為大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) [CMCC(B)26003]。

1.2 ε-聚賴氨酸-細菌纖維素(PLBC)復合膜制備

將若干BC膜片浸泡于100 mL一定濃度(0、0.5%、1.0%)的ε-PL溶液中，并將其置于超聲清洗器中超聲震蕩，使BC與ε-PL充分接觸吸附均勻，總吸附時間為1 h，分3次重復震蕩，間隔時間10 min。將吸附后的膜片放入濃度為15%甘油中，1～2 s后迅速取出，取出后瀝干表面多余液體，于60℃烘箱烘干至恒重供測試使用。

1.3 PLBC復合膜結構和性能

1.3.1PLBC復合膜SEM微觀結構觀察 使用S-3400N型掃描電子顯微鏡觀察PLBC復合膜的微觀結構。具體參數為：使用電壓為10 kV，工作距離5 400～5 600 μm,將樣品固定在銅板上在離子濺射儀中真空噴金，然后觀察表面形貌。

1.3.2吸水率和脫水率測定 將1.0 g左右(具體稱重記為W1)的BC膜/PLBC復合膜在常溫下浸入蒸餾水中，每間隔2 h稱其重量，直至恒重。將樣品取出后離心分離，稱重記為W2，吸水率計算公式如下：

吸水率(%)=(W2-W1)/W2×100。將測定完稱重后的樣品置于平皿中37℃通風干燥，每隔0.5～1 h稱重，至恒重，繪制脫水率曲線。

1.3.3PLBC復合膜的分子結構紅外光譜分析 采用傅里葉紅外光譜儀測試PLBC復合膜的分子結構。將制備好的膜樣品剪取2.5 cm×2.5 cm的方塊后，充分干燥，取一定樣品研碎后與KBr混合并倒入模具中壓片。取樣品進行紅外光譜的測定，波長范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，結合紅外光譜數據庫對所得紅外光譜進行分析。

1.3.4PLBC復合膜的分子結構X射線衍射 用X射線衍射儀分析PLBC復合膜的分子結構。具體參數為：采用Cu靶，加速電壓為40 kV，電流強度為200 mA，樣間隔0.02°，0.15°·s-1，范圍2～60°。

1.3.5PLBC復合膜力學性能測定

(1)PLBC復合膜拉伸強度測定。利用質構儀對PLBC復合膜的拉伸強度進行測定。將膜裁剪成8 cm×1 cm的長條，有效拉伸長度為50 mm，拉伸強度為5 mm·s-1，將復合膜系于拉伸探頭上，啟動儀器，使探頭慢慢向上拉至膜斷裂。記錄復合膜斷裂時的最大張力(F)、伸長距離(L)、應力(σ)、應變(ε)。每個樣品做3次平行試驗。按下列公式計算拉彈性模量：

E=σ/ε

其中，E表示楊氏模數，σ表示正向應力，ε表示正向應變。

(2)PLBC復合膜斷裂伸長率(BE)的測定。如上所述，記錄測試樣品模斷裂時的標線之間的距離L和斷裂時膜被拉伸的長度ΔL。按下列公式計算：

BE(%)=ΔL/L×100

1.4 PLBC復合膜抑菌活性測定

1.4.1培養基 LB培養基：酵母膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，pH 7.4，121℃滅菌20 min。LB固體培養基：酵母膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH 7.4，121 ℃滅菌20 min。

1.4.2菌株活化 于超凈工作臺中用無菌接種環分別接1環大腸桿菌和金黃色葡萄球菌到裝有50 mL LB培養基的三角瓶(250 mL體積)中，200 r·min-1、37℃振蕩培養12 h，備用。

1.4.3PLBC復合膜抑菌性能測定

(1)抑菌圈法。將BC膜及PLBC復合膜分別用打孔器打出φ8 mm的圓形膜，置于紫外燈下輻照30 min殺菌備用。取無菌培養皿若干套，每皿加入融化的20 mL LB固體培養基作為底層，凝固。將融化并冷卻至45℃左右的LB固體培養基(100 mL)加入50%葡萄糖液1 mL和活化好的大腸桿菌或金黃色葡萄球菌菌液3～5 mL，充分混勻，立即取5 mL均勻平鋪在已凝固的底層培養基上，凝固成為上層培養基。待培養基凝固后，用無菌鑷子將圓形膜分別放置于培養基上，輕輕將膜攤平，蓋上平皿蓋后，正置于37 ℃培養箱中培養18～24 h，培養結束后用游標卡尺測量抑菌圈直徑大小。

(2)吸光度法。于超凈工作臺中取0.2 mL大腸桿菌或金黃色葡萄球菌菌液(預先培養至對數增長期，大約培養8～10 h)接入裝有20 mL無菌LB液體培養基中，分別放入經紫外燈滅菌的BC膜及PLBC復合膜，37℃、120 r·min-1振蕩培養，每隔2 h用酶標儀檢測培養液吸光度(A660)的變化，檢測抗菌膜對指示菌生長的抑制情況。

1.4.4PLBC復合膜的抑菌曲線 內容物溶出試驗：將大腸桿菌或金黃色葡萄球菌培養過夜(8～12 h)，無菌生理鹽水洗滌2次，離心收集菌體，并重懸于無菌生理鹽水中，用無菌生理鹽水稀釋(A630約為0.6)，分別將0.5%(w/v)的BC膜及PLBC復合膜加入菌懸液中，培養過程中，分別用酶標儀記錄吸光度(A260及A280)的變化曲線。

2 結果與分析

2.1 PLBC復合膜的制備

發酵獲得的BC(圖1A)用粉碎機粉碎后經酸堿酸浸泡，漂白干凈后于烘箱烘干獲得純BC膜(圖1B)。將BC膜置于不同濃度的ε-PL溶液中，經浸泡吸附并恒溫烘干后獲得PLBC復合膜(圖1C)。從圖2可知，加入ε-PL后，膜展現出良好的均一性， PLBC復合膜的色澤及表觀形態與BC膜相比未見明顯區別。

注：A為發酵獲得的BC；B為BC膜；C為PLBC復合膜圖1 BC、BC膜與PLBC復合膜表觀形態Fig.1 Morphology of BC, BC membrane and PLBC composite membrane

2.2 PLBC復合膜的結構和性能表征

2.2.1PLBC復合膜的微觀結構觀察 由圖2可知，BC膜具有明顯的三維網絡結構和孔隙結構(圖2A)。對比不同ε-PL處理的PLBC復合膜可以發現，當ε-PL濃度為0.5%時，獲得的PLBC復合膜仍保持了與BC膜類似的納米纖維網絡結構，網絡與孔隙結構均明顯(圖2B)，當ε-PL濃度提高時至1%時，BC膜吸附ε-PL的量明顯增加，ε-PL的結晶增多，獲得的復合材料的空間網絡結構和孔隙均變差(圖2C)，影響了材料的微觀結構，因此本研究在制備PLBC復合膜試驗中，ε-PL濃度選擇0.5%比較適宜。

注：A為BC膜；B為BC膜+0.5%ε-PL；C為BC膜+1%ε-PL圖2 BC和PLBC復合膜的SEM圖像Fig.2 SEM images of BC and PLBC composite membrane

2.2.2PLBC復合膜吸水率和脫水率分析 分別考察了純BC膜及PLBC復合膜的溶劑吸收率，吸收率分別為457.19%±5.62%、397.36%±4.77%。PLBC復合膜的溶劑吸收率低于純BC膜，可能由于ε-PL的吸附，占據了一定的BC膜空間，從而影響了溶劑的吸附，但PLBC復合膜仍然表現出優良的吸收性能。由圖3可知，BC膜與PLBC復合膜均在2 h內完成了脫水。

圖3 PLBC復合膜脫水速率Fig.3 Dry-down rate of PLBC composite membrane

2.2.3PLBC復合膜紅外光譜分析 由圖4可知，PLBC復合膜保留了BC膜的特征吸收峰，即3 341 cm-1處由-OH鍵伸縮振動引起的一個大的吸收帶，以及2 897 cm-1處由-CH-伸縮振動引起的吸收峰。而且，從圖4B可以看出，ε-PL與BC膜形成了新的氫鍵吸收峰位于3 341 cm-1處，光吸收強度變大，在1 558 cm-1處存在特征峰是由-NH2振動引起的，說明PLBC復合膜中存在-NH2，因此證明了PLBC復合膜的成功制備。

注： A為BC膜；B為PLBC復合膜圖4 BC膜與PLBC復合膜的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrogram of BC membrane and PLBC composite membrane

注：A為BC膜；B為PLBC復合膜圖5 BC膜與PLBC復合膜X射線衍射分析圖譜Fig. 5 X-ray diffraction analysis map of BC membrane and PLBC composite membrane

2.2.5PLBC復合膜力學性能分析 由表1、圖6可知，PLBC復合膜的力學特性與BC膜相比較在應力、應變、彈性模量及斷裂伸長率方面均有了不同幅度的提高，這意味著ε-PL的加入使得BC膜的韌性及拉伸強度增強，將有利于PLBC復合膜在抗菌食品包裝方面的應用。

表1 BC膜與PLBC復合膜的力學性能Table 1 Mechanical properties of BC membrane and PLBC composite membrane

A：BC膜；B：PLBC復合膜圖6 BC膜與PLBC復合膜的彈性Fig.6 Elasticity of BC membrane and PLBC composite membrane

2.3 PLBC復合膜抑菌活性測定

2.3.1抑菌圈法 由圖7可知，在涂布E.coli的平板上，BC膜周圍無抑菌圈，揭開貼于瓊脂表面的BC膜，發現膜下方亦有細菌繁殖，說明純BC膜對E.coli無抑菌活性。PLBC復合膜周圍有明顯的抑菌圈，膜下方無細菌繁殖(圖7A)，說明PLBC復合膜對E.coli具有良好的抑菌活性。當以S.aureus為抑菌活性測試菌種時，PLBC復合膜對S.aureus也具有良好的抑菌活性(圖7B)。

注：A為E.coli抑菌試驗；B為S.aureus抑菌試驗圖7 BC膜及PLBC復合膜抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of BC membrane and PLBC composite membrane

2.3.2吸光度法 由圖8可知，空白試驗中菌體生長曲線與添加BC膜的菌體生長曲線是幾乎重疊的，說明純BC膜對E.coli及S.aureus生長無抑制效果，這與2.3.1中抑菌圈法結果是一致的。PLBC復合膜吸光度曲線與0.5%純ε-PL吸光度曲線基本接近，說明PLBC復合膜中的ε-PL可以近似完全地釋放出來而發揮抑菌效果，也側面說明了BC膜吸附ε-PL后可以比較好地釋放從而產生抑菌作用，PLBC復合膜的抑菌活性來自ε-PL。從結果分析，PLBC復合膜對G+及G-菌都表現出良好的抑菌效果。

A為大腸桿菌；B為金黃色葡萄球菌圖8 吸光度法測定PLBC復合膜對E.coli及S.aureus的抑菌效果Fig.8 Determination of the antibacterial effect of PLBC composite membrane on E.coli and S.aureus by using the absorbance method

2.3.3PLBC復合膜對E.coli與S.aureus的抑菌機制 由圖9可知，當分別向E.coli菌液中添加BC膜、PLBC復合膜、ε-PL時，PLBC復合膜、ε-PL組的A260及A280均明顯高于BC膜組及空白菌懸液試驗組，以S.aureus作試驗菌時，結果亦與E.coli菌相似。根據文獻報道，付萍等[20-21]通過電鏡觀察發現ε-PL對E.coli與S.aureus的抑菌機制主要為造成細胞膜的損傷。當細胞膜損傷出現孔洞時，菌體中的內容物核酸及蛋白質便會釋放出來，通過測定菌液的A260及A280可以檢測菌體裂解后核酸及蛋白質的釋放情況，反映抑菌試劑的抑菌效果。當PLBC復合膜與ε-PL加入菌懸液后，A260及A280在短時間內迅速上升，說明PLBC復合膜與ε-PL一樣具有良好的抑菌活性，也印證了PLBC復合膜對抑菌機制為損傷E.coli與S.aureus的細胞膜。

A為A260；B為A280圖9 PLBC復合膜的添加對A260及A280的影響Fig.9 Effect of the addition of PLBC composite membrane on A260及A280

3 討論與結論

本研究通過超聲震蕩使BC與ε-PL充分接觸吸附后制備出了PLBC復合膜。對PLBC復合膜的各項性能進行考察，發現PLBC復合膜的溶劑吸收率低于BC膜，脫水率則兩者相當。觀察到ε-PL的結晶會影響PLBC復合膜的微觀結構，ε-PL濃度選擇0.5%比較適宜。紅外光譜分析顯示PLBC復合膜保留了BC膜的特征峰，同時存在新的氫鍵吸收峰以及由-NH2振動引起的特征峰。XRD分析表明ε-PL沒有影響BC的結晶結構。在力學特性上，PLBC復合膜的應力、應變、彈性模量及斷裂伸長率均較BC膜有了不同幅度的提高。通過抑菌圈法與吸光度法考察了BC膜與PLBC復合膜對E.coli及S.aureus的抑菌作用，PLBC復合膜中的ε-PL可以近似完全地釋放出來而發揮抑菌效果。初步檢測分析了PLBC復合膜對E.coli與S.aureus的抑菌機制，結果表明PLBC復合膜與ε-PL的抑菌機制一致，可通過損傷細胞膜造成菌體凋亡。本課題制備所得的PLBC復合膜具有良好的性能及抑菌表現，在醫用敷料、食品的保鮮包裝等眾多領域中將具有廣泛的應用潛力。