基于16sRNA擴增子測序分析患爛皮病棘胸蛙皮膚的細菌多樣性

張雪萍，徐 莉，符宏高，陳美玲，黃其鍛，陸永樹，耿寶榮，陳友鈴*，黃 鎮*

(1.福建師范大學生命科學學院/福建省發育與神經生物學重點實驗室， 福建 福州 350117； 2.福建省健豐生物科技有限公司， 福建 泉州 362500； 3.福建省石凍王生物技術研發中心有限公司， 福建 泉州 362500； 4.福建省南平市政和縣天富盈農業專業合作社， 福建 南平 353602)

棘胸蛙Quasipaaspinosa是我國南方的大型食用蛙，因其具有食藥用價值而受到人們的青睞，是我國近年來養殖蛙類中的主要品種之一。由于市場需求的增加和棲息地的破壞，野生棘胸蛙的數量急劇下降[1]。人工養殖是滿足市場需求和保護野生棘胸蛙的最佳途徑[2]。然而，在養殖過程中，由于養殖餌料的投喂、養殖密度大等因素，導致棘胸蛙在養殖過程中頻發疾病，嚴重制約了棘胸蛙產業的發展。棘胸蛙養殖過程中，常見的疾病有：紅腿病、白內障、腹水病、歪頭病等[3]，其中爛皮病是棘胸蛙養殖過程中較為常見的病害之一，其癥狀發病初期表現為食欲減退，表皮無光澤，然后表皮脫落并開始潰爛，出現白斑，甚至指骨和頜骨外露。該病傳染性強，死亡率很高，嚴重影響棘胸蛙養殖經濟效益[4-6]。

前期研究發現多種病菌會引起棘胸蛙的爛皮病，例如王瑞君等[4]對患爛皮病的棘胸蛙進行致病菌分離，經鑒定該致病菌株為奇異變形桿菌。胡靄臻等[5]從病死的爛皮病棘胸蛙頭部、腿部和肝部分離得到3株病原菌，分別命名為LJ10201、LJ10202、LJ10203，經鑒定，確認LJ10201、LJ10203菌株為弗氏檸檬酸桿菌，LJ10202菌株為布氏檸檬酸桿菌。呂耀平等[6]從患爛皮病的棘胸蛙中分離并篩選出3株致病菌BS1、BS2和BS3，經鑒定上述3株菌均為蠟樣芽孢桿菌。鄭榮泉等[7]從患病瀕死的棘胸蛙爛皮部位深層皮膚及肝臟組織分離病原菌，發現不動桿菌在患病棘胸蛙中占主導地位。肖波[8]從患腐皮病的棘胸蛙成蛙皮膚病灶、肌肉組織和肝臟中分離病原菌，發現嗜水氣單胞菌是棘胸蛙腐皮病的主要病原。由這些研究結果可知，棘胸蛙爛皮病的細菌病原呈現多樣性，容易受到環境因子的影響，在不同的地區、不同的養殖環境各不相同。因此，在不同的地區開展棘胸蛙爛皮病的監測，對于棘胸蛙病害防治有著積極的作用。

常規的細菌性疾病檢測方法為培養法，該方法是將發生疾病的組織取出勻漿后，在營養瓊脂培養基上進行培養，然后分離出單菌落進行鑒定。該方法只能針對可培養的細菌進行鑒定，對于整個組織的細菌群落結構解析不夠全面[9]。16sRNA擴增子測序技術是鑒定非培養的或難以鑒定的細菌的有用工具，大大提高了分析復雜微生物種群組成的能力，并為研究人員提供更精確的分類信息。16sRNA基因由于其分子大小適中、突變率小而成為細菌系統分類研究中最常用的標記[10]。本研究通過細菌16sRNA片段高通量測序技術和生物信息學分析手段，對人工養殖的患爛皮病棘胸蛙的健康皮膚和潰爛皮膚菌群進行比較分析，有助于了解棘胸蛙皮膚的菌群結構及潛在致病菌，為棘胸蛙的健康養殖以及病害防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

3只患爛皮病的棘胸蛙活體取自三明市三元區眾源棘胸蛙養殖專業合作社。根據外觀診斷，棘胸蛙身上的皮膚存在局部潰爛。為了減少試驗誤差，在患病棘胸蛙背部選擇直徑1.0～1.5 cm的健康和潰爛部位的皮膚作為取樣點(圖1)。每只棘胸蛙用無菌蒸餾水清洗2次，以減少暫時性表面細菌。在無菌超凈工作臺內，從枕骨大孔插針快速處死，解剖。分別迅速取其健康皮膚樣本和潰爛皮膚樣本。健康皮膚樣本編號為HS1、HS2和HS3，組成健康皮膚組(Healthy Skin)。潰爛皮膚樣本編號為RS1、RS2和RS3，組成潰爛皮膚組(Rotten Skin)。樣品液氮速凍后置于-80℃保存待用。

注：A、B、C為3只患爛皮病的棘胸蛙活體。紅圈為潰爛部位皮膚；藍圈為健康部位皮膚。圖1 患爛皮病的棘胸蛙皮膚Fig.1 Skin of Quasipaa spinosa affected with the rotten-skin disease

1.2 樣品總DNA提取、PCR擴增及高通量測序

在冰上用組織勻漿機將棘胸蛙皮膚樣品勻漿后，根據說明書用Soil DNA Kit試劑盒(Omega Bio-Tek，USA)提取細菌總DNA。通過在2%的瓊脂糖凝膠中電泳分析總DNA質量和完整性，并使用NanoDrop(ND2000，Thermo Scientific)對DNA濃度進行定量分析。用細菌特異性引物：341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)對16sRNA基因可變區(V3～V4區)進行PCR擴增。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行基于IlluminaHiSeq測序平臺的高通量測序。

1.3 測序處理和質控

根據PE reads之間的overlap關系，使用cutadapt 1.18去除Read1 3′端測序引物接頭AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA和Read2 3′端測序引物接頭AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT后，用PEAR 0.9.8將成對的reads拼接(merge)成一條序列；然后按照barcode標簽序列識別并區分樣品得到各樣本數據，同時校正序列方向；最后用PRINSEQ 0.20.4對各樣本數據的質量進行質控過濾，切除reads尾部質量值20以下的堿基，設置10 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后的含N序列和短序列，最終過濾掉低復雜度的序列，得到各樣本有效數據。

通過聚類操作，用Usearch 11.0.667將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，1個小組就是1個OTU(可操縱分類單元，Operational Taxonomic Units)。根據不同的相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，通常對97%及以上相似水平的OTU進行生物信息統計分析。

1.4 數據分析

使用mothur 1.43.0軟件計算群落豐富度指數(Chao指數、Ace指數)、群落多樣性指數(Shannon 指數、Simpson指數)和樣品覆蓋率；使用R軟件v3.6.0繪制稀釋曲線和等級分布曲線并進行結構分析及聚類分析；使用STAMP v1.1進行顯著性分析；通過對組間樣本進行比較，在各分類水平上找出兩組中具有顯著差異的物種。

2 結果與分析

2.1 棘胸蛙皮膚樣本16sRNA測序結果

由表1可知，棘胸蛙6個皮膚樣本16sRNA的擴增和測序，共得到有效讀長684 478條，平均每個樣品114 080條。所有樣品測序覆蓋度均為100%，表明測序比較真實反映各樣品的微生物組成。

表1 各樣品OTUsTable 1 OTUs of each sample

2.2 棘胸蛙皮膚菌群多樣性分析

對患爛皮病棘胸蛙的6個皮膚樣本的測序數據經過OTU比對后，繪制了不同樣品的稀釋曲線，由圖2A可知，所有的樣品稀釋曲線均隨序列數量的增加而趨于平緩，表明所測的數據量已經可以反映微生物群落結構和多樣性。同時，對樣品繪制等級分布曲線，由圖2B可知，在水平方向上，健康皮膚組的曲線在橫軸上的跨度大于潰爛皮膚組，表明棘胸蛙健康皮膚的微生物物種數目高于潰爛皮膚，同時在垂直方向上健康皮膚組的曲線比潰爛皮膚組陡峭，表明棘胸蛙健康皮膚中存在相對豐度明顯占優的細菌種類。

注：A為健康皮膚與潰爛皮膚樣品的稀釋度曲線；B為健康皮膚與潰爛皮膚樣品細菌多樣性的等級分布曲線。圖2 健康皮膚與潰爛皮膚樣品的稀釋度曲線和等級分布曲線Fig.2 Curves of the rate of dilution and grade distribution for the samples of healthy skin and ulcerated skin

從表2可知，健康皮膚組微生物的ACE指數、Chao 1指數均高于潰爛皮膚組，表明患爛皮病棘胸蛙健康皮膚中微生物的物種數目高于潰爛皮膚。健康皮膚組微生物的Shannon指數高于潰爛皮膚組，并且Simpson指數低于潰爛皮膚組，表明在微生物多樣性方面，棘胸蛙健康皮膚中微生物的菌群多樣性高于潰爛皮膚。最后，所有6個樣品的覆蓋率均為1，表明了測序深度合理，能飽和覆蓋到樣品中的微生物種群。

表2 各樣品高通量測序結果分析Table 2 Analysis of the high-throughput sequencing results of each sample

2.3 棘胸蛙皮膚菌群結構分析

首先從細菌分類的門水平上對健康皮膚組和潰爛皮膚組的細菌群落組成進行比較。由圖3A可知，健康皮膚的優勢菌門是藍細菌門/葉綠體(Cyanobacteria Chloroplast，50.7%)、變形菌門(Proteobacteria，21.99%)、厚壁菌門(Firmicutes，7.88%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，3.6%)、放線菌門(Actinobacteria，2.27%)，其他門類占比不足1%。由圖3B可知，潰爛皮膚的優勢菌門是變形菌門(Proteobacteria，98.88%)，其他門類占比不足1%。其中健康皮膚和潰爛皮膚的菌群結構存在顯著差異。除變形菌門Proteobacteria為健康皮膚和潰爛皮膚的共有優勢菌門之外，健康皮膚和潰爛皮膚的優勢菌門均不相同。

注：A為基于門水平的健康皮膚菌群相對豐度；B為基于門水平的潰爛皮膚菌群相對豐度；C為基于屬水平的健康皮膚菌群相對豐度；D為基于屬水平的潰爛皮膚菌群相對豐度。圖3 健康皮膚與潰爛皮膚的菌群相對豐度(基于門和屬水平)Fig.3 Relative abundance of the microflora in the healthy skin and ulcerated skin (based on the phylum and genus levels)

其次，在細菌分類的屬水平上，共鑒定出15個主要屬。由圖3C可知，健康皮膚的主要優勢菌屬為鏈形植物屬(Streptophyta，50.24%)、不動桿菌屬(Acinetobacter，5.25%)，其他菌屬不足5%。由圖3D可知，潰爛皮膚的主要優勢菌屬為不動桿菌屬(Acinetobacter，98.33%)，其他菌屬不足5%。其中不動桿菌屬為健康皮膚和潰爛皮膚的共有屬，潰爛皮膚中的不動桿菌屬的含量顯著高于健康皮膚。鏈形植物屬為健康皮膚特有的細菌種屬。

2.4 棘胸蛙皮膚菌群結構差異分析

2.4.1樣品聚類分析 根據OTU的類型將所有樣品進行聚類分析，結果見圖4。在細菌分類的門和屬水平上，所有樣品均明顯聚成2大支，一支為健康皮膚組樣品，另一支為潰爛皮膚組樣品，表明2組樣品之間存在明顯的差異。

注：A為基于門水平的健康皮膚與潰爛皮膚菌群結構聚類分析；B為基于屬水平的健康皮膚與潰爛皮膚菌群結構聚類分析。圖4 聚類分析健康皮膚與潰爛皮膚的菌群結構(基于門和屬水平) Fig.4 Cluster analysis of the microbial community structure of healthy skin and ulcerated skin (based on the phylum and genus levels)

2.4.2顯著性差異分析 為了進一步解析棘胸蛙健康皮膚與潰爛皮膚在屬水平上細菌群落結構的差異性，將兩組樣本利用STAMP 進行顯著性差異分析。由圖5可知，健康皮膚組與潰爛皮膚組的菌群存在顯著差異，不動桿菌屬在潰爛皮膚中大量存在。而鏈形植物屬在健康皮膚中的細菌數高于潰爛皮膚。

注：左欄為不同細菌菌群在兩組樣本中的比例情況，右欄為95%置信度區間內的差異比例，右欄縱軸為p值。圖5 健康皮膚與潰爛皮膚的差異細菌菌群(基于屬水平)Fig.5 Differential bacterial community between the healthy skin and the ulcerated skin (based on the genus level)

3 討論與結論

疾病暴發是棘胸蛙養殖業健康發展的主要障礙。在養殖過程中，主要的疾病是體表有潰爛傷口的爛皮病。由于蛙沒有毛皮或羽毛，不斷地暴露在外部環境的影響下，生活在動物皮膚上的微生物群落被認為是疾病易感性的媒介，提供了抵御病原體的第一道防線[11-12]。盡管不同個體之間的水平傳播(例如在交配期間)或垂直傳播(即親代傳給后代，盡管不常見)也是潛在的病原菌來源，但是蛙類微生物組的主要來源是外部的水生和土壤環境，它們被認為是蛙皮微生物群的儲存庫。目前研究表明，蛙表皮的微生物組具有物種特異性，這些微生物組成受到季節性變化、采樣個體、生命階段、身體部位、飲食、捕獲地點、棲息地、圈養、接觸人為污染物和抗生素治療的影響[13-15]。因此，在本研究中只考慮屬于同一物種、同一發育階段、同一地點的不同個體標本，同時還在同一個個體上分別分析了健康皮膚和潰爛皮膚的細菌多樣性，目的是將皮膚感染性疾病的存在與構成皮膚微生物區系的其他因素隔離開來。

本試驗結果也證實16sRNA片段高通量測序與其他依賴培養或不依賴培養的方法相比，可以更深入地檢查皮膚細菌群落的組成。Woodhams等[9]從黃腿蛙Ranamuscosa的皮膚中培養出40個獨特的細菌分離物，僅屬于3個不同的門類。本研究中所有健康皮膚樣本的細菌群落由有限的門類主導，即藍細菌門/葉綠體(50.7%)、變形菌門(21.99%)、厚壁菌門(7.88%)、擬桿菌門(3.6%)和放線菌門(2.27%)，這些門類與類似研究中發現的主導門類基本相同[12, 16-18]。而棘胸蛙潰爛皮膚中細菌群落的優勢菌門只有變形菌門(98.88%)，變形菌門在潰爛皮膚中高度富集。這些結果與Federici等[12]的研究結果不同，他們在健康和患病的意大利河蛙Ranaitalica中觀察到相似的細菌門類豐度，但細菌門類不同。而Hu等[19]在健康和患病的虎紋蛙Hoplobatrachusrugulosus中觀察到相似的細菌門類，但細菌門類豐度不同。在屬水平上，健康皮膚中細菌群落的主要優勢菌屬為鏈形植物屬(50.24%)、不動桿菌屬(5.25%)。潰爛皮膚中細菌群落的優勢菌屬為不動桿菌屬(98.33%)。這些結果與Federici等[12]的研究結果不同，并未有與本研究相同的優勢菌屬。而Hu等[19]在虎紋蛙的研究中，除不動桿菌為健康和患病虎紋蛙皮膚菌群的共有優勢菌屬、并且潰爛皮膚中的不動桿菌屬含量明顯高于健康皮膚之外，其他優勢均屬均不相同。

不動桿菌是一種專性需氧細菌，它普遍存在于皮膚以及土壤、水和植物根際[20]。不動桿菌的功能在以前的幾個研究中是相互矛盾的。一方面，據廣泛報道，不動桿菌在醫院和其他醫療機構引起感染和流行傳播，對醫療系統構成巨大威脅[21]。另一方面，它們對于生物膜的形成是必要的，并有助于構建和保護其他生物系統中的微生物群落[22]。在本研究中，潰爛皮膚中的不動桿菌屬豐度明顯高于健康皮膚。這一結果與先前對虎紋蛙皮膚的細菌微生物組評估結果一致[19]。可以得出，本研究中棘胸蛙潰爛皮膚上發現的不動桿菌豐度劇增對于棘胸蛙的健康狀態是有害的。

本研究中發現，健康皮膚和潰爛皮膚菌群多樣性及結構存在顯著差異。相比于潰爛皮膚，健康皮膚的細菌多樣性更高，根據多樣性抗性假說，微生物群落越多樣化，寄主越有可能抵抗病原菌入侵[23]。這一結果與意大利河蛙的結果相似，健康皮膚樣本的微生物群多樣性明顯較高[12]。相反，在虎紋蛙的研究中，沒有發現蛙個體的健康皮膚和潰爛皮膚的菌群多樣性存在顯著差異，健康皮膚和潰爛的蛙的皮膚微生物豐富度和均勻度是相似的[19]。因此利用菌群多樣性來評估宿主健康是有限的。同時，健康皮膚和潰爛皮膚的細菌群落結構明顯不同，表明細菌群落與棘胸蛙爛皮病的感染發病之間可能存在一定的關系。有研究發現，當蛙的皮膚處于健康狀態時，健康的皮膚也寄生著大量的致病菌，這些菌群在皮膚表面相互作用形成微生態平衡[18, 24]，健康皮膚上的共生微生物占據了廣泛的生態位，并有效地保護個體免受病原體的侵害[25]。而這種平衡一旦被打破，皮膚微生物群的改變可能會導致病原菌的增加。病原菌的入侵破壞了健康皮膚菌群的組成，皮膚微生物群失調可能會導致宿主的疾病易感性[13, 18, 26-30]。

此外，研究人員廣泛研究了兩棲動物皮膚微生物組的致病細菌和有益細菌[31-32]。益生菌在水產動物生產中越來越多地被用作添加劑，以提高動物的生長、免疫和抗病能力，并作為水質調節劑改善水質[33]，但非宿主來源的益生菌在使用過程中存在潛在風險，因此更值得關注和探索宿主來源的益生菌。本研究中，發現雙歧桿菌Bifidobacterium等潛在益生菌存在于棘胸蛙健康皮膚中。而鏈球菌Streptococcus、泛菌Pantoea、副擬桿菌Parabacteroides、腸桿菌科Enterobacteriaceae、黃桿菌科Flavobacteriaceae、鞘脂單胞菌科Sphingomonadacea、金黃桿菌屬Chryseobacterium等水生動物常見的條件致病菌均有發現，這些發現為棘胸蛙益生菌的開發和細菌性疾病的防控提供了參考。

總之，皮膚菌群與動物皮膚的免疫功能密切相關，建立良好的宿主皮膚-微生物生態系統對維護宿主健康非常必要。本研究結果表明，棘胸蛙健康皮膚和潰爛皮膚的菌群多樣性和結構存在顯著差異。藍細菌門/葉綠體、變形菌門、厚壁菌門是棘胸蛙健康皮膚微生物的優勢菌門，變形菌門中的不動桿菌屬在棘胸蛙潰爛皮膚中高度富集，這說明健康皮膚狀況與棘胸蛙的皮膚菌群結構密切相關。然而本研究在棘胸蛙的健康皮膚和潰爛皮膚中檢測到的明顯不同的菌屬如何參與皮膚的免疫功能，都是值得進一步開展研究的。