基于網絡藥理學探討桂枝芍藥知母湯治療痛風的作用機制

何家穎 劉明嶺 李淑瑤 王馨玉 關 彤

1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院風濕病科，廣東廣州 510405

痛風是一種尿酸鹽沉積所致的關節病，與嘌呤代謝紊亂和/或尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥相關。目前我國的痛風患病率為1%～3%，呈逐年上升、年輕化的趨勢[1]。痛風易反復發作，長期服藥可導致肝、腎功能損害，而且在降尿酸的初始階段還可能誘導痛風急性發作[2]。桂枝芍藥知母湯具有祛風除濕、溫經散寒、滋陰清熱的功效，可治療痛風的外因（風寒濕邪侵襲）和內因（肝腎虛損，營衛不和）。藥理研究表明桂枝芍藥知母湯具有抗炎、鎮痛、保護腎功能和促進尿酸排泄的作用[3]。

網絡藥理學從多維度視角理解疾病的分子基礎，預測藥物的藥理學機制[4]，揭示了中醫藥的科學性和有效性。本研究基于網絡藥理學方法，從成分、靶點、通路等多方面共同探討桂枝芍藥知母湯治療痛風的作用機制。

1 材料與方法

1.1 收集桂枝芍藥知母湯的活性成分、對應靶點和痛風靶點

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數據庫中分別以“桂枝、白芍、知母、甘草、麻黃、生姜、白術、防風、附子”為檢索詞，以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18 為篩選條件檢索活性成分，結合相關文獻補充活性成分。在TCMSP 數據庫中獲取對應靶點，采用Uniprot 數據庫進行標準化處理。以“gout”為檢索詞分別檢索OMIM、GeneCards、DisGeNET 和TTD 數據庫，收集合并痛風相關靶點。

1.2 構建疾病-藥物-靶點-成分網絡和蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡

利用Cytoscape 軟件中的Merge 插件將藥物與疾病靶點取交集，并構建疾病-藥物-靶點-成分網絡。設置物種為人類，將共同靶點分別輸入STRING 數據庫和Metascape 數據庫，應用Cytoscape 軟件構建PPI網絡圖和繪制PPI 富集分析圖。

1.3 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

設定閾值為P ＜0.05，應用R 軟件對共同靶點進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，并繪制條形圖。

2 結果

2.1 桂枝芍藥知母湯活性成分和對應靶點、疾病靶點、共同靶點

從TCMSP 數據庫中獲得桂枝芍藥知母湯活性成分119 個，從文獻補充活性成分6 個，總活性成分125 個，對應靶點218 個，疾病靶點903 個，共同靶點60 個。

2.2 疾病-藥物-靶點-成分網絡

疾病-藥物-靶點-成分網絡見圖1，該網絡包含180 個節點，458 條邊，節點顏色越深，度值越高。經統計，度值前8 的核心成分見表1，其中槲皮素、山柰酚、柚皮素和β-谷甾醇既是核心成分又是共同成分。

表1 核心成分

圖1 疾病-藥物-靶點-成分網絡圖

2.3 PPI 網絡和PPI 富集分析

PPI 網絡見圖2，該網絡包含58 個節點，595 條邊，節點越大，顏色越深，度值越高。核心靶點包括IL-6、TNF、GAPDH、VEGFA、TP53、PTGS2、IL-1B、TLR4 和JUN（原癌基因）。PPI 富集分析見圖3，形狀相同的靶點共同參與某種生物過程或分子功能或細胞組分。

圖2 蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

圖3 蛋白質-蛋白質相互作用富集分析圖

2.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

GO 富集分析獲得條目95 個，KEGG 通路富集分析獲得通路130 條，按P 值從小到大排列，排名前20的GO 條目和通路繪制成條形圖，見圖4～5。GO 功能富集分析主要涉及磷酸酶結合、金屬內肽酶活性、MAPK活性、轉錄因子結合、氧化還原酶活性等分子功能，KEGG 通路富集分析共獲得7 條與痛風密切相關的信號通路，分別是TNF 信號通路、TLR 信號通路、IL-17 信號通路、Th17 細胞分化、CLR 信號通路、NF-κB 信號通路和糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路，同時還獲得流體剪切應力和動脈粥樣硬化、類風濕關節炎等信號通路。

圖4 GO 分析圖

3 討論

痛風急性期的特征之一是發病部位存在中性粒細胞募集[5]，典型表現是關節紅、腫、熱、痛。β-谷甾醇可抑制中性粒細胞遷移以減輕炎癥[6]，其他核心成分也都具有抗炎作用。槲皮素、山柰酚、柚皮素、木犀草素、升麻素和肉桂醛具有鎮痛作用，6-姜酚、升麻素和肉桂醛具有解熱作用[7-13]。高尿酸血癥是痛風的生化基礎，木犀草素和山柰酚作為黃嘌呤氧化酶抑制劑，其能阻斷次黃嘌呤、黃嘌呤轉化為尿酸[14]。

本研究發現核心靶點多與炎癥相關，其中TP53的功能獲得性突變在炎癥中起關鍵作用[15]。IL-1β 和IL-6 皆為痛風重要的炎癥介質，IL-1β 是調節炎癥的起始因子，TNF-α 通過調節pro-IL-1β mRNA 的表達可增加IL-1β 的分泌[16]。IL-6 可擴大炎癥，且與關節畸形、骨破壞、痛風石有關[17]。GAPDH 是巨噬細胞產生IL-1β、IL-6 等促炎因子所必需的[18]，PTGS2 在促炎因子的刺激下產生前列腺素參與炎癥。VEGF 與炎癥呈正相關，VEGFA 能增加血管通透性，從而刺激炎癥形成和發展[19]。

PPI 富集分析發現桂枝芍藥知母湯不僅作用于炎癥，還作用于痛風石的生長、尿酸代謝等。圖3A 主要與轉錄因子有關，NF-κB 是痛風最重要的轉錄因子之一，其能調節炎癥反應，還能促進動脈粥樣硬化相關基因的表達。圖3B 主要與肽酶活性、細胞外基質有關，其與MMP1、MMP2、MMP9 聯系最緊密。研究發現痛風石中的巨噬細胞可產生MMP2 和MMP9，MMP的主要功能是降解細胞外基質[20]，痛風石外層的肉芽腫會隨細胞外基質的降解而生長，同時巨噬細胞會發生凋亡，這可能會限制巨噬細胞的破壞潛力[21]。圖3C主要與血脂代謝有關，血脂與尿酸呈正相關[22-24]，桂枝芍藥知母湯通過調節APOB、LDLR 和PON1 可降低尿酸和血脂水平。

GO 富集分析發現磷酸酶結合和MAPK 活性參與痛風骨破壞、細胞代謝和炎癥過程。痛風患者的骨吸收表面、關節液及痛風石內存在大量的酸性磷酸酶，此酶與破骨細胞的活性呈正相關，可增強骨吸收，促進骨破壞。受尿酸單鈉晶體刺激時MAPK 被激活，其參與細胞凋亡的延遲和NETosis[25]。NETosis 是中性粒細胞特殊的死亡方式，發生過程中會形成中性粒細胞胞外誘捕網[26]，中性粒細胞胞外誘捕網可產生中性粒細胞胞外誘捕網交聯體，其含有的中性粒細胞蛋白酶可降解促炎因子，限制炎癥反應[5]。

圖5 KEGG 通路富集分析圖

KEGG 通路富集分析共獲得7 條與痛風密切相關的信號通路。其中AGE-RAGE、TNF 和TLR 的信號傳導均受下游NF-κB 和MAPK 信號通路的控制。AGE-RAGE 信號傳導通過激活NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPK 等多條信號通路，從而激活NF-κB，參與炎癥反應?？扇苄訲NF 通過TNFR1 傳遞的信號通路主要激活促炎通路[27]，包括NF-κB 和MAPK 信號通路，最終導致白細胞激活和募集、促炎因子產生、炎癥介質合成等。TLR 信號傳導途徑：①MyD88 依賴性途徑：尿酸單鈉晶體與TLR 結合后可活化MyD88，繼而激活下游NF-κB 和MAPK 信號通路產生促炎因子，快速激活固有免疫。②MyD88 非依賴性途徑：TLR激活T 細胞并介導其趨化，從而激活適應性免疫。CLR 也能激活固有免疫和適應性免疫，同時還參與了多種關節病[28]。CLR 通過激活NLRP3炎癥小體，產生IL-1β，其與IL-6、TNF 等細胞因子共同促進Th1 和Th17 細胞分化，參與痛風的炎癥反應。Th17 細胞的系統分化、成熟和局部募集及其產物IL-17 是痛風引起靶組織損傷的潛在機制之一。IL-17 抗體可調節尿酸單鈉晶體引起的痛風性炎癥，減輕關節癥狀和白細胞炎癥浸潤[29]。

綜上所述，本研究借助網絡藥理學的方法發現：①桂枝芍藥知母湯在治療痛風的炎癥反應、尿酸代謝紊亂、骨破壞等多個環節中發揮顯著作用。②NF-κB和MAPK 信號通路是痛風發病的核心，阻斷他們是痛風治療的關鍵。③巨噬細胞的凋亡和中性粒細胞胞外誘捕網的產生都與痛風自限性有關，另外IL-17 抗體可減輕痛風性關節炎的關節癥狀和白細胞炎癥浸潤，這些都為痛風的治療提供了新思路。④桂枝芍藥知母湯通過調節APOB、LDLR 和PON1 靶點，NF-κB和糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路有助于治療高脂血癥、動脈粥樣硬化等痛風常見的合并癥。本研究具有一定的局限性，一是著重探討痛風的炎癥反應，對尿酸代謝、骨破壞等方面的研究尚未深入；二是本研究的結論有待今后的臨床試驗和實驗研究驗證。