超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定新生兒血漿中氟康唑的濃度

覃冬杰 李 萍 吳 婧 梁 婧 韋艷飛 蔣永江 于橋愛 何 靜 王宏虹

1.柳州市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究中心藥品科，廣西柳州 545006；2.柳州市婦幼保健院 廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院、兒童醫(yī)院藥學(xué)部，廣西柳州 545001；3.柳州市婦幼保健院 廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院、兒童醫(yī)院新生兒科，廣西柳州 545001；4.柳州市婦幼保健院 廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院、兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣西柳州 545001

近年來，新生兒重癥監(jiān)護(hù)室真菌感染的發(fā)病率、死亡率呈逐年上升趨勢[1-3]，氟康唑是目前治療全身性真菌感染的首選藥物，臨床使用較為廣泛[4-7]。對于存在真菌感染高危因素的新生兒，早期給予預(yù)防性氟康唑治療可明顯降低真菌的定殖率和感染率，有效降低侵襲性真菌感染的發(fā)病率及死亡率[8-11]。常規(guī)治療藥物監(jiān)測方法有高效液相色譜法[12-14]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-17]。高效液相色譜法由于靈敏度的局限性，需較大釆血量才能達(dá)到分析要求，然而新生兒特別是早產(chǎn)兒體重較輕，釆血量過大易導(dǎo)致醫(yī)源性貧血，危及健康[18]。因此，為了新生兒氟康唑血藥濃度監(jiān)測工作的順利開展，建立一種釆血量小，高效、快速、靈敏的測定方法尤為必要。本研究旨在建立一種測定新生兒血漿中氟康唑濃度的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法，為臨床監(jiān)測其血藥濃度提供檢測手段。

1 一般材料

1.1 儀器

1290-6430 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（電化學(xué)噴霧離子源，美國安捷倫公司）；SK8200HP 超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；3-3OK 臺式高速離心機(jī)（德國Sigma 公司）；VIBRAX VXR 振蕩器（德國IKA 集團(tuán)）；XP26 電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司，0.01 mg）；24 UV 超純水器（德國默克密理博公司）。

1.2 藥品

氟康唑?qū)φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號100314-201605，含量99.7%）；非那西丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100095-201606，含量100%）；甲醇（美國Fisher Scientific 公司）為色譜純；水為自制超純水；其余化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18RRHD（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：30℃；流速：0.3 ml/min；流動相A：0.1%甲酸，流動相B：甲醇。梯度洗脫：0～0.50 min 80%A，0.50～3.00 min 80%～20%A，3.00～4.50 min 20%A，4.50～4.51 min 20%～80%A，4.51～6.00 min 80%A；進(jìn)樣量：1 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電化學(xué)噴霧離子源，正離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式采集。離子源溫度：350℃；干燥器流量：8 L/min；毛細(xì)管電壓4000 V，霧化器壓力45 psi。化合物參數(shù)分別為氟康唑：母離子質(zhì)核比（m/z）307.1，定量子離子m/z 220.0，碎裂電壓90 V，碰撞能量15 V。非那西丁：母離子m/z 180.1，定量子離子m/z 110.0，碎裂電壓110 V，碰撞能量15 V。質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 氟康唑和非那西丁的二級質(zhì)譜圖

2.2 對照品及內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密稱取氟康唑?qū)φ掌?.005 mg 置于5 ml 容量瓶，加純化水溶解并定容至刻度，制成濃度為1.001 mg/ml的對照品儲備液。精密稱取非那西丁對照品5.131 mg置于5 ml 容量瓶，加純化水溶解并定容至刻度，制成濃度為1.026 mg/ml 的內(nèi)標(biāo)儲備液，取儲備液定量稀釋制成濃度為0.5131 μg/ml 的內(nèi)標(biāo)使用液。

2.3 血漿樣品的制備及處理

2.3.1 含藥血漿樣品的制備 取空白血漿，精密加入氟康唑?qū)φ掌肥褂靡哼m量，使血漿樣品的濃度分別為：0.1001、0.5005、1.0010、5.0050、10.0100、20.0200、50.0500、60.0600 μg/ml。

2.3.2 血漿樣品的處理 取50 μl 血漿樣品，加入50 μl非那西丁內(nèi)標(biāo)使用液，加乙腈400 μl，渦旋1 min，4000 r/min 離心2 min（離心半徑為3 cm），取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，待測。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取6 份空白血漿樣品及濃度為1.0010 μg/ml 的含藥血漿樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對待測成分無干擾，專屬性高。見圖2。

圖2 血漿中氟康唑和非那西丁色譜圖

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下的含藥血漿樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示：回歸方程為Y=0.5325X+0.1762（r=0.9999），氟康唑在0.1001～60.0600 μg/ml 濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。見圖3。以10 倍基線噪音時所對應(yīng)的氟康唑濃度確定定量限為0.01 μg/ml。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度 精密量取含藥血漿樣品（濃度分別為0.5005、10.0100 和50.0500 μg/ml）各5 份，于5 d 內(nèi)每日按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，每份樣品分別測定1 次，考察日內(nèi)及日間精密度；將實(shí)測濃度與理論添加濃度進(jìn)行比較，考察準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度RSD 分別為3.74%、1.38%和2.59%，日間精密度RSD 分別為8.88%、1.88%和2.38%，準(zhǔn)確度分別為（86.0±3.5）%、（98.1±1.6）%和（99.0±2.2）%。

2.4.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 精密量取含藥血漿樣品（濃度分別為0.5005、10.0100 和50.0500 μg/ml）各5 份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，每份樣品分別測定1 次，得氟康唑峰面積（A）；另取空白血漿，按“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，用獲得的空白基質(zhì)液配制基質(zhì)對照品溶液，使其與前者濃度一致，測定，得氟康唑峰面積（B）；再取氟康唑?qū)φ掌啡芤海?0%乙腈配制成相同濃度的溶劑對照品溶液，測定，得氟康唑峰面積（C）。提取回收率=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%。結(jié)果顯示，提取回收率分別為（103.3±5.7）%、（87.8±2.8）%和（98.7±3.7）%，基質(zhì)效應(yīng)分別為（103.6±2.5）%、（102.1±1.8）%和（101.3±1.6）%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取含藥血漿樣品（濃度分別為0.5005、10.0100 和50.0500 μg/ml）各5 份，分別于室溫放置12 h、-20℃反復(fù)凍融3 次及-20℃冷凍放置30 d 后，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，每份樣品分別測定1 次，考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，室溫放置12 h 后穩(wěn)定性RSD分別為8.53%、1.35%和2.07%，-20℃反復(fù)凍融3 次后穩(wěn)定性RSD 分別為4.35%、1.54%和1.43%，-20℃冷凍放置30 d 后穩(wěn)定性RSD 分別為4.66%、2.53%和2.26%。

2.5 臨床樣品測定

選擇2020 年7 月至11 月柳州市婦幼保健院新生兒科住院患兒10 例，因預(yù)防或治療侵襲性念珠菌感染給予氟康唑，于給藥后取靜脈血0.5 ml，分離血漿，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，測定氟康唑血藥濃度，見表1。本研究經(jīng)柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者監(jiān)護(hù)人知情并簽署知情同意書。

表1 患兒基本情況及血藥濃度測定結(jié)果

3 討論

采用內(nèi)標(biāo)法定量測定，可以減少由儀器系統(tǒng)或操作過程產(chǎn)生的誤差。新生患兒由于基礎(chǔ)疾病較多，會使用較多的、不同類型的藥物進(jìn)行治療，選取一種自身不含且不會應(yīng)用于新生兒的成分作為內(nèi)標(biāo)尤為重要。本研究選取非那西丁作為內(nèi)標(biāo)，并考察了它的色譜保留行為。結(jié)果顯示，氟康唑與非那西丁的保留時間相近，兩色譜峰能完全分開，且不受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，說明非那西丁作為本研究的內(nèi)標(biāo)物較合適。

在血漿樣品處理時，有文獻(xiàn)報(bào)道用液液萃取法[19-20]、固相柱萃取法[21]和蛋白沉淀法[22-24]，本研究在比較甲醇和乙腈沉淀蛋白時，發(fā)現(xiàn)乙腈作為蛋白沉淀劑時的提取效率較甲醇高，故選用乙腈作為蛋白沉淀劑。

早產(chǎn)兒是侵襲性真菌感染的高危人群，氟康唑的新生兒治療用量為3～12 mg/kg，≤2 周的患兒每隔72 h給藥1 次，預(yù)防真菌感染的用法用量尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒按3 mg/kg 給藥后氟康唑血藥濃度處于低水平維持，足月兒按6 mg/kg 給藥后個體差異較大。因此，氟康唑用于該人群的用藥劑量、有效性、安全性需進(jìn)一步研究探討。

本研究建立的方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，各項(xiàng)指標(biāo)均符合生物樣品定量分析的相關(guān)要求[25]。每個樣品僅需50 μl 即可進(jìn)行分析測定，用量較小，適用于新生兒血漿中氟康唑濃度的測定。