正交試驗法優選復方益腎利石顆粒的提取工藝

覃新華 陳 娟 李 巖 游 攀 胡傳義

1.寧夏醫科大學研究生培養基地 上海市浦東新區公利醫院，上海 200135；2.上海市浦東新區公利醫院泌尿外科，上海 200135

復方益腎利石湯是上海市浦東新區公利醫院的臨床經驗方，主要用于泌尿系結石的輔助治療，經長期用藥觀察，復方益腎利石湯可顯著降低術后腎損傷、結石殘留率和并發癥發生率[1-3]。全方由金錢代化草、海金沙、生雞金等藥材組成。本實驗按照現代中藥藥物制劑的需求優化提取工藝，使其適合現代生產[4]。采用單因素考察和正交設計[5]，以方中有效成分的綜合評分為評價指標，對溶劑倍數、提取時間及提取次數進行考察，確定最佳提取工藝，為顆粒提取工藝提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XS105 十萬分之一電子天平[（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）]；DK-S26 六孔水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；UV-2102PCS 紫外-可見光分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；Agilent1200 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；MWD 檢測器（美國安捷倫科技公司）。

1.2 試藥

海金沙、金錢草、生雞金、石葦、車前子、川斷、杜仲、枳殼、炒蒲黃藥材均購于上海萬仕誠藥業有限公司（批號分別為：200111-1、200103-1、200227-1、200217-1、200211-1、200226-1、200213-1、191218-1、191218-1）；川續斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、新橙皮苷對照品、蘆丁均來源于中國食品藥品檢定研究院（批號分別為：39524-08-8、110722-201815、111857-201804、100080）；超純水（廣州屈臣氏飲料食品有限公司）；乙腈、甲醇均為色譜純（上海默克化工技術有限公司，批號分別為：166579、2019706）。

2 方法與結果

2.1 評價指標

按照《中華人民共和國藥典》2020 年版[6]和相關文獻資料[7-8]，分別制備9 味藥的提取樣品，經檢測，選取總黃酮、川續斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、新橙皮苷含量及其轉移率作為提取工藝的考察指標。

復方益腎利石顆粒樣品的制備：海金沙30 g、金錢草30 g、生雞金30 g、石葦15 g、車前子20 g、川斷12 g、杜仲12 g、枳殼15 g、炒蒲黃15 g，加8 倍量水，提取3 次，每次1 h，得提取物，真空干燥、粉粹得浸膏粉。

2.1.1 總黃酮含量測定 ①溶液的制備，取蘆丁對照品25 mg 置50 ml 量瓶中，加30%乙醇適量，超聲溶解，放冷，加30%乙醇至刻度，取上述溶液10 ml 置50 ml量瓶中，加30%乙醇至刻度，即得對照品溶液。取本品1 g（批號：2020072901）置具塞錐形瓶中，加30%乙醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量，濾過。取續濾液5 ml 置50 ml 量瓶中，加30%乙醇至刻度，即得供試品溶液。②線性關系考察[9]，吸取蘆丁對照品儲備液制備成系列標準曲線溶液，濃度分別為：0.099、0.198、0.297、0.396、0.495 mg/ml，于510 nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標（Y），以濃度為橫坐標（X），繪制回歸曲線。結果總黃酮的回歸方程為Y=1.3212X-0.0022（r2=0.9999），表明總黃酮在0.099～0.495 mg/ml 范圍內線性關系良好。③精密度試驗，取供試品溶液3 ml，于510 nm 波長處連續測定6 次。結果吸光度的相對標準偏差（RSD）=0.16%（n=6），提示儀器的精密度良好。④穩定性試驗，取供試品溶液1 ml 置10 ml 量瓶中，依次在510 nm 波長下，分別測定0、0.5、1、1.5、2、3 h 時間點溶液的吸光度。結果，總黃酮含量的RSD=0.43%（n=6），提示供試品溶液在3 h 內穩定性良好。⑤重復性試驗，取同一批號的樣品6 份（批號：2020092301），參照①項方式制備供試品溶液。依次在510 nm 波長處進行測定，結果吸光度的RSD=1.49%（n=6），提示本方法重復性良好。⑥加樣回收率試驗，稱定已知總黃酮含量的同一批號的供試品溶液6 份（批號：2020092301），加蘆丁對照品，參照①項下方式制備供試品溶液。于510 nm 波長處進行測定并計算加樣回收率。結果顯示，總黃酮平均回收率為98.08%（RSD=0.01%，n=6），顯示該方法具有良好的加樣回收率。見表1。

表1 總黃酮含量測定回收率試驗結果

2.1.2 柚皮苷、新橙皮苷含量測定 色譜條件[10-11]：高效液相儀，Agilent 1200、MWD 檢 測器、Agilent 1200 工作站；色譜柱，Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相，乙腈-水（20∶80）（用磷酸調節pH 值至3）；檢測波長283 nm。對照品溶液的制備：取柚皮苷對照品、新橙皮苷對照品適量，加甲醇分別制成每1 ml 含柚皮苷1.0 mg、新橙皮苷0.5 mg 的標準溶液。供試品溶液的制備：取浸膏粉0.2 g 置具塞錐形瓶中，加甲醇50 ml，加熱回流提取1.5 h，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量。取續濾液10 ml 置25 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得。

2.1.3 線性關系考察 取柚皮苷、新橙皮苷對照品溶液，按上述色譜條件進行測定，分別以對照品進樣濃度的對數值（X）為橫坐標，峰面積的對數值（Y）為縱坐標，繪制回歸曲線。見表2。可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.1.4 精密度試驗 取同一供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，連續進樣6 次，記錄峰面積。測定柚皮苷、新橙皮苷峰面積峰RSD 均<3%，顯示儀器的精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 取供試品溶液1 份，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進樣，得柚皮苷、新橙皮苷峰面積RSD分別為0.16%和0.19%，顯示供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取供試品溶液6 份，精密吸取注入液相色譜儀測定，得柚皮苷、新橙皮苷峰面積RSD 均<2%，顯示該方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 稱取已知柚皮苷、新橙皮苷含量的供試品6 份（批號：2020092303），分別加入適量對照品溶液。分別吸取供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，計算平均加樣回收率和RSD。結果測得柚皮苷的平均加樣回收率為98.33%，RSD 為0.35%，新橙皮苷的平均加樣回收率為99.31%，RSD 為0.17%。見表3～4。

表3 柚皮苷加樣回收率

表4 新橙皮苷加樣回收率

2.2 提取工藝條件的研究

2.2.1 浸泡時間及藥材吸水率考察 稱取半分處方藥材（共89.5 g），加10 倍量水，浸泡0.5、1、2、3、4、5、6、24 h 后過濾，稱藥渣重量，測吸水率[12]。從圖1 可知，藥材浸泡30 min 時吸水量為1.3 倍，在2 h 后的吸水量趨向于平緩。故從生產的實際出發，提取浸泡時間定為0.5 h。

圖1 吸水率試驗

2.2.2 提取次數 取4 份全處方量藥材，分別加8 倍量水，提取時間1 h，提取1、2、3、4 次各指標有效成分。從圖2 可知，隨提取次數增加，各指標有效成分溶出不斷增加，但提取次數增加至第4 次，含量增長速率變緩。參照實驗室和工業化生產的實際情況，選擇提取1、2、3 次進行正交試驗。

圖2 提取次數試驗

2.2.3 提取時間 取5 份全處方量藥材，加8 倍量水，分別提取0.5、1、1.5、2、3 h 各指標有效成分，提取2 次[13-14]。從圖3 可知，在提取0.5～1 h，三種成分不斷增加，超過1.5 h 后，含量均呈下降平穩趨勢，故選擇0.5、1.0、1.5 h進行正交試驗。

圖3 提取時間試驗

2.2.4 溶劑倍數 取4 份全處方量藥材，分別加6、8、10、12 倍量水，提取1 h，提取2 次[15-16]。從圖4 可知，有效成分溶出在4～8 倍加水量，隨水量的增加不斷增加，超過10 倍水量后，各含量均呈下降趨勢，故選擇加6、8、10 倍水進行正交試驗。

圖4 溶劑倍數試驗

2.2.5 正交試驗 在上述實驗的基礎上，進一步優化復方益腎利石顆粒的提取工藝，采用三因素三水平設計[17-19]，考察空白（A）、提取次數（B）、提取時間（C）和溶劑倍數（D）因素對各指標及得膏率的影響。按照L9（34）正交表進行正交試驗。正交設計因素水平見表5～6。本研究應用多指標綜合評分法優化顆粒的提取工藝[20]，利用層次分析法[21]得各指標權重系數，見表7。綜合評分=總黃酮總含量得分×0.4452+川續斷皂苷Ⅵ轉移率得分×0.3086+柚皮苷轉移率得分×0.1118+新橙皮苷轉移率得分×0.1118+干膏得率得分×0.0226。正交設計及綜合評分結果見表8～9，通過綜合評分的方差分析可知提取次數＞提取時間＞溶劑倍數＞空白，即B＞C＞D＞A，差異有統計學意義（P ＜0.05）；通過綜合評分的直觀分析可知因素B 中K3＞K2＞K1，提示提取次數的增加，綜合評分越高；因素C中K2＞K3＞K1，選擇提取時間為1 h；因素D 中K3＞K2＞K1，K3 和K2 相差極小，選擇溶劑倍量為8 倍。綜合評分的最佳組合為B3C2D1，即最佳提取工藝為：8 倍量水，提取3 次，每次1 h。

表5 因素水平設計方案

表6 正交試驗安排

表7 各成分權重系數

表8 正交試驗結果

2.3 驗證實驗結果

稱取處方中9 味藥材，共3 份，按優選工藝進行提取。結果浸膏得率均值為22.54%，總黃酮總含量均值為1762.09 mg，川續斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、新橙皮苷轉移率均值分別為36.92%、97.71%、78.25%，三批驗證樣品的轉移率RSD 均＜7.0%，出膏率RSD ＜3.0%，結果顯示提取工藝穩定，可重復，適用于大生產。

3 討論

本研究充分考慮復方益腎利石顆粒的安全性、有效性，建立多個指標的綜合評分法考察提取工藝[22-24]。綜合評分法是中藥提取工藝多個指標評價的常用方法，能更好反映復方中藥的安全性、有效性、整體性及復雜性[25]。本研究根據中藥復方君臣佐使配伍原則，通過綜合分析予以各指標權重系數，計算綜合評分，避免單一因素對中藥復方提取工藝篩選的局限性和片面性，為進一步優化復方益腎利石顆粒提取制備工藝提供了科學的實驗依據。

表9 綜合評分方差分析表