黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠的干預作用

劉晶晶 盧麗 胡鳳琪 袁海 高丹

(湖北文理學院附屬醫院 襄陽市中心醫院腎臟內科,湖北 襄陽 441201)

系膜增生性腎炎是一種常見的原發性腎小球疾病，其中腎小球內系膜細胞數增多和系膜基質聚集是其主要的病理改變；隨著病情的惡化，腎小球會出現不同程度的硬化，最終導致腎衰竭〔1〕。目前，系膜增生性腎炎的治療以免疫抑制劑和糖皮質激素為主，但效果并不理想〔2〕。黃芩苷是一種從中藥黃芩中提取的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等廣泛的藥理活性〔3～5〕。黃芩苷可通過減弱炎癥反應和凋亡等改善糖尿病腎病、急性腎損傷和腎缺血再灌注損傷等疾病的腎功能，進而發揮腎臟保護作用〔6～8〕。然而，黃芩苷在系膜增生性腎炎方面的研究較少。本研究通過觀察黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠腎功能、炎癥反應和腎組織細胞凋亡的影響，探討黃芩苷改善和治療系膜增生性腎炎的可能性。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1主要試劑 牛血清白蛋白(美國Sigma)，白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒和尿素氮(BUN)檢測試盒、尿酸(UA)測定試劑盒、肌酐(Scr)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)試劑盒(美國Promega)，右美托咪定(江蘇恒瑞醫藥)。

1.1.2動物 6～8周齡健康雄性Wistar大鼠32只，體重200～220 g，購于鄭州大學動物實驗中心。在溫度為(20.00±2.00)℃、濕度(55.00±10.00)%且通風良好的環境中自由進食飲水。

1.2實驗方法

1.2.1系膜增生性腎炎大鼠模型的構建和實驗分組 隨機選取6只大鼠作為對照組，只給予等體積的生理鹽水，其余26只構建系膜增生性腎炎大鼠模型；參照文獻〔2〕構建系膜增生性腎炎大鼠模型。實驗大鼠適應性飼養1 w后，進行建模。具體步驟如下：以400 mg/kg牛血清白蛋白隔日灌胃后，皮下注射0.1 ml四氯化碳(純度99.5%)和0.5 ml蓖麻油(純度99%)，每周1次，連續5 w；在第5周未聯合0.05 mg脂多糖(純度1%)生理鹽水靜脈注射。造模過程中死亡6只，剔除24 h尿蛋白定量不合格的2只后，將構建成功的18只系膜增生性腎炎大鼠隨機分為模型組、黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組，每組各6只。所有大鼠正常飲食飲水，黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組大鼠從第6周開始分別腹腔注射25 mg/kg、50 mg/kg 黃芩苷，每日1次，而對照組和模型組腹腔注射等量的生理鹽水，每日1次。連續4 w。

1.2.2大鼠一般情況觀察 每天觀察各組大鼠的精神狀態，攝食和飲水情況，分別在造模的第6、8和10周測量大鼠的體重。

1.2.324 h尿蛋白含量的檢測 在造模的第6、8、10周未收集各組大鼠24 h的尿液，并參照BCA蛋白定量試劑盒說明書檢測24 h尿蛋白含量。

1.2.4血液中BUN、Scr、UA含量和IL-6、TNF-α含量的檢測 實驗結束后，腹腔注射10%水合氯醛對大鼠進行麻醉后，取動脈血，室溫下靜置2 h。以2 000 r/min離心10 min取血清。分別參照BUN、Scr、UA試劑盒和IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中BUN、Scr、UA、IL-6、TNF-α的含量。

1.2.5腎組織形態學檢測 實驗結束后處死大鼠，取腎臟組織，制成厚度為3 μm的石蠟切片。采用蘇木素-伊紅、過碘酸雪夫染色，在顯微鏡高倍鏡下觀察切片中腎皮質部分6個大小相似的腎小球，運用高清晰度彩色病理圖像分析系統分析每個腎小球中過碘酸雪夫染色陽性的腎小球總面積和系膜基質面積，統計腎小球內系膜細胞數并以陽性面積與腎小球總面積的比值表示系膜基質陽性面積比。

1.2.6腎組織細胞凋亡檢測 采用TUNEL法檢測各組大鼠腎組織細胞的凋亡情況。將石蠟切片以二甲苯浸洗脫蠟后，以梯度乙醇進行水化；以4%多聚甲醛固定后，采用磷酸緩沖液浸洗2次；滴加濃度為20 μg/ml的蛋白酶K稀釋液處理15 min；加入100 μl平衡液平衡10 min后，加入100 μl TUNEL反應混合液封膜室溫反應1 h。浸入0.3% 過氧化氫中封閉15 min后，加入100 μl辣根過氧化酶標記的鏈霉抗生物素蛋白孵育30 min；經二氨基聯苯胺顯色后，封片。采用光學顯微鏡觀察并統計細胞核中被染成深棕色的陽性細胞數，即細胞凋亡數，并以陽性細胞數與100個細胞的比值表示凋亡指數。

1.3統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠一般情況的影響 與對照組比較，其余各組大鼠呈現不同程度的精神萎靡、攝食減少，體重減輕；與模型組比較，黃芩苷高、低劑量組大鼠的精神狀態和活力明顯改善，8、10 w體重有明顯升高(P<0.05)，但黃芩苷低劑量和高劑量組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠24 h尿蛋白含量的影響 造模6 w后，模型組、黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組24 h尿蛋白含量較對照組均明顯升高(P<0.05)；從造模8 w后黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組大鼠24 h尿蛋白含量明顯低于模型組(P<0.05)，且黃芩苷濃度越高24 h尿蛋白含量下降越明顯(P<0.05)。見表1。

表1 黃芩苷對大鼠體重及24 h尿蛋白含量的影響

2.3黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠腎組織形態學的影響 與對照組比較，模型組、黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組腎小球內系膜細胞數和系膜基質陽性面積比值均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組中腎小球內系膜細胞數和系膜基質陽性面積比值明顯降低(P<0.05)，且黃芩苷高劑量組中這兩個指標的下降幅度明顯大于黃芩苷低劑量組(P<0.05)。見表2。

2.4黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠腎功能的影響 與對照組比較，模型組、黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組血清中BUN、Scr和UA含量均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組中BUN、Scr和UA含量均明顯降低(P<0.05)；并且，黃芩苷高劑量組中BUN、Scr和UA含量明顯低于黃芩苷低劑量組(P<0.05)。見表2。

2.5黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠腎血清中IL-6和TNF-α含量的影響 模型組、黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組血清中IL-6和TNF-α含量較對照組均明顯升高(P<0.05)，黃芩苷低、高劑量組中IL-6和TNF-α含量明顯低于模型組(P<0.05)，并且黃芩苷高劑量組中IL-6和TNF-α含量明顯低于黃芩苷低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 右美托咪定對大鼠腎組織形態學、腎功能及IL-6、TNF-α的影響

2.6黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠腎組織細胞凋亡影響 與對照組(2.05±0.56)比較，模型組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組腎組織細胞凋亡指數明顯升高(16.75±2.26、22.58±2.32、28.49±1.16，P<0.05)；與模型組比較，黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組中細胞凋亡指數明顯升高(P<0.05)，且黃芩苷高劑量組明顯高于黃芩苷低劑量組(P<0.05)。

3 討 論

系膜增生性腎小球腎炎是一種免疫介導的炎癥相關性疾病〔9〕，細胞增殖和凋亡失調導致的腎小球系膜細胞過度增殖，分泌大量炎癥因子如IL-6和TNF-α等，而這些炎癥因子又可以進一步刺激系膜細胞增殖，導致系膜細胞外基質過度聚集，最終引起腎小球硬化和腎功能衰竭〔1，10，11〕。因此，有效抑制腎小球系膜細胞過度增殖并促進其凋亡、減輕炎癥反應、改善腎功能對系膜增生性腎小球腎炎防治具有重要意義。

黃芩苷是一種天然的黃酮類化合物，因具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理活性而受到廣泛關注；黃芩苷可通過減弱細胞炎癥反應和調控細胞增殖、凋亡等在腦、心肌和肝等組織中表現出較好的保護作用〔12～14〕。例如：Shah等〔15〕指出，黃芩苷可通過降低氧化應激和抑制核因子-κB介導的炎癥因子如IL-1β和TNF-α表達減弱脂多糖誘導的毒性而發揮神經保護作用。Luan等〔16〕指出，黃芩苷可通過激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B和抑制核因子-κB信號傳導抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應減輕心肌缺血再灌注損傷。此外，黃芩苷在改善腎臟相關疾病損傷方面發揮著重要作用。例如：Yang等〔17〕研究發現，黃芩苷可通過降低24 h尿蛋白、尿β2微球蛋白、尿白蛋白排泄率改善腎功能，并可通過抗炎、抗氧化等多種途徑延緩糖尿病腎病的進展。楊驥等〔18〕報道，黃芩苷可通過抑制濾泡輔助T細胞分化保護狼瘡鼠腎臟損傷。奚百順等〔19〕指出，黃芩苷可通過降低腎組織中TNF-α水平改善膿毒癥大鼠早期腎功能損傷。然而，黃芩苷在系膜增生性腎小球腎炎方面的研究較少。

本研究以黃芩苷干預后發現，構建的系膜增生性腎小球腎炎大鼠精神狀況和體重有所改善，腎功能相關指標24 h尿蛋白、BUN、Scr和UA含量明顯降低，炎癥相關指標IL-6和TNF-α含量降低；同時還觀察到腎小球內系膜細胞數和系膜基質陽性面積比值明顯降低，而腎組織細胞凋亡指數明顯升高；并且，隨著黃芩苷濃度的升高，上述變化越顯著。本實驗結果與林銳珊等〔20〕研究得出的隨著黃芩苷濃度的升高，高糖環境下腎小球系膜細胞增殖抑制和促細胞凋亡能力越強的結果部分吻合。結果表明，黃芩苷可通過抑制炎癥反應和促進腎小球內系膜細胞凋亡改善系膜增生性腎小球腎炎大鼠的腎臟損傷。提示，黃芩苷具有保護系膜增生性腎小球腎炎腎功能的作用。

總之，黃芩苷可通過減少24 h尿蛋白排泄、改善腎功能、減弱炎性浸潤和腎組織細胞凋亡改善系膜增生性腎炎大鼠腎損傷。