低溫刺激下沙塵對大鼠肺組織損傷及作用機(jī)制

徐生剛 曹玉青 劉雨娟

(河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院，甘肅 張掖 734000)

沙塵天氣是一種強(qiáng)災(zāi)害天氣，尤其在冬春季節(jié)高發(fā)。研究表明，沙塵天氣使呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著上升〔1〕。Grineski等〔2〕研究表明沙塵天氣后1 d，兒童和青少年急性支氣管炎入院風(fēng)險(xiǎn)為正常天氣的1.33倍。蘭州市一項(xiàng)研究表明，沙塵暴后3 d，蘭州市呼吸系統(tǒng)疾病急診入院人數(shù)增多14.0%〔3〕。當(dāng)氣溫從某個(gè)臨界值降低會(huì)增加呼吸系統(tǒng)疾病死亡率和發(fā)病率。研究顯示，冬季氣溫每降低1℃，呼吸系統(tǒng)疾病死亡率就會(huì)增加3.3%〔4〕。Makinen等〔5〕研究表明氣溫每降低1℃，上呼吸道感染率增加4.3%，流感增加2.1%，咽炎增加2.8%，下呼吸道感染率增加2.1%。氣溫和大氣顆粒物對呼吸系統(tǒng)疾病的影響表現(xiàn)為交互作用，低溫能加劇大氣中的顆粒物對呼吸系統(tǒng)的損害。Ren等〔6〕研究顯示最低溫每降低10℃，呼吸系統(tǒng)疾病入院率在PM10<20 μg/m3和>40 μg/m3時(shí)分別增加1.0%和7.3%〔6〕。盡管目前關(guān)于沙塵和低溫對呼吸系統(tǒng)疾病影響的流行病學(xué)研究較多，但關(guān)于二者交互作用對呼吸系統(tǒng)損害的機(jī)制尚不明確。因此，本文探討不同低溫刺激下沙塵對大鼠肺組織的損害及作用機(jī)制，對治療和預(yù)防由冷空氣和沙塵導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)疾病有重要的意義。

1 材料與方法

1.1沙塵采集和處理 在2017和2018年3～4月，11～12月出現(xiàn)沙塵天氣時(shí)，利用粉塵采樣器和玻璃纖維濾膜，采集張掖市區(qū)室外空氣中的沙塵顆粒。采樣高度為5 m，每天采樣24 h，采樣流量為 100 L/min，連續(xù)采集。采集完成后的濾膜剪成約 1 cm×1 cm的方塊，收集于干凈的小燒杯內(nèi)，使用去離子水將其完全浸沒，利用超聲波清洗儀振蕩洗脫顆粒物，振蕩3次，30 min/次。多層紗布過濾，收集濾液于離心管中，8 000 r/min離心15 min，收集下層沉淀物于培養(yǎng)皿內(nèi)，真空冷凍干燥，顆粒物稱重后低溫避光保存待用。實(shí)驗(yàn)開始之前，用生理鹽水將沙塵制成懸液并超聲振蕩高溫高壓滅菌。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只8周齡SPF級健康雄性 Wistar 大鼠購自甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。體重(180.41±10.33) g，將40 只大鼠按體重隨機(jī)分成5組，每組8只。5組大鼠接受不同的處理，分別為：20℃+生理鹽水組、20℃+沙塵組、10℃+沙塵組、0℃+沙塵組、-10℃+沙塵組。染塵染毒采用非暴露式氣管滴注染毒法，大鼠用水合氯醛麻醉后固定，待大鼠呼吸平穩(wěn)后，將事先預(yù)熱的沙塵懸液注入大鼠氣管內(nèi)；1次/d，滴注量為1 ml/kg體重，連續(xù)3 d，每次間隔48 h，連續(xù)染毒3次。利用氣候模擬箱(寧波樂電)模擬低溫環(huán)境，每天持續(xù)低溫刺激2 h。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1肺灌洗液提取 末次沙塵染毒結(jié)束后將所有大鼠處死，分離暴露氣管，在氣管上用剪刀剪一斜口，插入帶有聚乙烯管的肺灌洗針頭，結(jié)扎固定。緩慢注入生理鹽水0.5 ml，然后用針管緩慢抽出灌洗液，邊抽邊輕輕按摩大鼠胸部。每只大鼠灌洗8次，記錄每只大鼠灌洗液總量。提取的肺灌洗液立即放入冰箱4℃保存。

1.3.2肺泡灌洗液處理 將提取的灌洗液在4℃下，10 000 r/min離心20 min，吸取上清液用于乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、白蛋白(ALB)、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平測定。

1.3.3肺組織勻漿制備 摘取右肺，并稱重，利用勻漿器在冰浴中將其制成10%組織勻漿，于低溫離心機(jī)4℃ 3 000 r/min 離心20 min，取上清液用于谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平測定。

1.3.4指標(biāo)測定 測定試劑均由南京建成生物制品公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定各指標(biāo)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同低溫刺激下沙塵對肺泡灌洗液炎性因子的影響 不同溫度沙塵組肺泡灌洗液IL-6 、IL-8、CRP、TNF-α水平均顯著高于20℃+生理鹽水組(P<0.05)。0℃+沙塵組、-10℃+沙塵組肺泡灌洗液IL-6 、 IL-8、CRP、TNF-α水平均顯著高于20℃+沙塵組和10℃+沙塵組(均P<0.05)，見表1。表明隨著溫度的降低，沙塵導(dǎo)致肺泡灌洗液IL-6 、IL-8、CRP、TNF-α 水平逐漸升高。

表1 不同低溫刺激及沙塵作用下肺泡灌洗液中炎性因子水平比較

2.2不同低溫刺激下沙塵對肺組織GSH-Px、SOD、MDA的影響 不同溫度沙塵組肺組織GSH-Px、SOD水平均顯著低于20℃+生理鹽水組，MDA水平均顯著高于20℃+生理鹽水組(均P<0.05)。0℃+沙塵組、-10℃+沙塵組肺組織GSH-Px、SOD水平均顯著低于20℃+沙塵組和10℃+沙塵組，MDA水平顯著高于20℃+沙塵組和10℃+沙塵組(均P<0.05)，見表2。表明隨著溫度的降低，沙塵導(dǎo)致肺組織GSH-Px、SOD水平逐漸降低，MDA水平逐漸升高。

表2 不同低溫刺激及沙塵作用下肺組織GSH-Px、SOD、MDA水平比較

2.3不同低溫刺激下沙塵對肺泡灌洗液LDH、AKP、ACP 、ALB的影響 不同溫度沙塵組肺泡灌洗液LDH、AKP、ACP 、ALB水平均顯著高于20℃+生理鹽水組(均P<0.05)。0℃+沙塵組、-10℃+沙塵組肺泡灌洗液LDH、AKP、ACP 、ALB水平均顯著高于20℃+沙塵組和10℃+沙塵組(均P<0.05)，表明隨著溫度的降低，沙塵導(dǎo)致肺泡灌洗液LDH、AKP、ACP 、ALB水平逐漸升高。見表3。

表3 不同低溫刺激及沙塵作用下肺灌洗液LDH、AKP、ACP、ALB水平比較

3 討 論

沙塵天氣發(fā)生時(shí)，空氣當(dāng)中不同粒徑顆粒物的濃度明顯升高〔7〕。低溫刺激和大氣顆粒物都可能導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率和死亡率增加，且當(dāng)?shù)蜏睾皖w粒物同時(shí)存在影響更大。低溫會(huì)導(dǎo)致呼吸道纖毛受損，受損的纖毛對顆粒物的清除作用減弱，從而導(dǎo)致更多顆粒物進(jìn)入呼吸道，加重沙塵對呼吸系統(tǒng)的損傷。

Wang等〔8〕發(fā)現(xiàn)沙塵天氣采集的PM2.5使支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B IL-6、 IL-8水平上升。冷空氣刺激促使肺細(xì)胞炎性因子IL-6、IL-8的表達(dá)增強(qiáng)〔9〕。本研究結(jié)果表明沙塵可誘發(fā)肺組織的炎癥反應(yīng)，低溫刺激和沙塵的交互作用可使炎癥介質(zhì)增多，炎性反應(yīng)增強(qiáng)，氣溫越低沙塵對呼吸系統(tǒng)損傷越嚴(yán)重。

研究表明沙塵中的PM2.5能夠誘導(dǎo)肺組織發(fā)生氧化應(yīng)激損傷〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)大鼠暴露于PM2.5 7～14 d，肺組織中GSH-Px活性降低、MDA的含量明顯升高〔11〕。本研究結(jié)果表明沙塵會(huì)造成肺組織氧化損傷，低溫會(huì)加重沙塵對肺組織氧化損傷，氣溫越低氧化損傷越重。

LDH是胞質(zhì)酶，ACP 是溶酶體酶，當(dāng)細(xì)胞膜受損或細(xì)胞死亡溶解后會(huì)大量釋出；ALB反映肺泡上皮毛細(xì)血管屏障損傷程度；AKP活性提示肺泡Ⅱ型細(xì)胞受損程度。本研究結(jié)果表明氣溫越低，沙塵對肺組織細(xì)胞的毒性作用越強(qiáng)，低溫會(huì)加重沙塵對肺組織細(xì)胞的毒性損傷。

綜上，低溫刺激可能會(huì)增加沙塵對呼吸系統(tǒng)的損傷，其主要機(jī)制是低溫刺激會(huì)增強(qiáng)沙塵顆粒物對肺組織的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞毒性作用，溫度越低炎癥反應(yīng)越重、氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞毒性作用越強(qiáng)，對肺組織的損害越大。