miR-138通過促進PDK1和激活AKT信號通路促進膠質母細胞瘤細胞增殖

吳海濤 陳小忠 趙洪新 張平 楊朝 鄭超

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州 遵義 563000)

多形性膠質母細胞瘤(GBM)是成人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性神經(jīng)上皮性腫瘤，占顱內腫瘤的16%，約占顱內惡性腫瘤的50%〔1,2〕。GBM患者的平均存活期是12個月〔3〕，目前臨床對于GBM的治療方法為常規(guī)的放療、化療和手術切除〔4〕，但接受這些常規(guī)治療后患者5年生存率僅為5.5%〔5〕，且易復發(fā)〔6〕。miRNA是一類小分子非編碼RNA，可通過序列互補配對結合到靶基因的mRNA上，調節(jié)靶基因的表達和翻譯〔7〕。miR-138是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高表達的miRNA〔8〕，可參與調節(jié)軸突的發(fā)育和再生〔9〕。有研究表明，miR-138在骨性關節(jié)炎患者中表達，并通過激活核因子(NF)-κB通路促進對軟骨組織的破壞〔10〕。本研究擬通過收集GBM患者的臨床標本，檢測miR-138的表達，并通過細胞實驗檢測miR-138的功能，以期為其發(fā)病機制提供新視野。

1 材料與方法

1.1臨床標本 收集2017年1月至2018年12月遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院就診的膠質母細胞瘤患者的腦組織標本，并收集低級別膠質瘤患者的腦組織標本和非瘤患者的腦組織作對照。膠質母細胞瘤和低級別膠質瘤的診斷按照《中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質瘤診斷與治療指南(2015)》的標準確診。根據(jù)臨床診斷，將患者分為膠質母細胞瘤組、低級別膠質瘤組和非瘤組。膠質母細胞瘤組男32例，女21例，平均年齡(64.2±10.8)歲；低級別膠質瘤組男31例，女26例，平均年齡(61.0±15.3)歲；非瘤組男38例，女31例，平均年齡(66.7±19.1)歲。3組一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2試劑與細胞 膠質母細胞瘤細胞系T98G、H4、U251和U87細胞購自中科院細胞庫，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Sigma公司，RT-聚合酶鏈反應(PCR)所用的反轉錄試劑盒、SYBR-GREEN試劑盒均購自TOYOBO公司，轉染試劑盒購自Sigma Aldrich公司。miR-control、miR-138的mimic和inhibitor和Trizol Reagent均購自Thermo Fisher Scientific公司，小RNA提取試劑盒、加尾法miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒均購自康為世紀生物公司，抗丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)1抗體、抗AKT抗體和抗p-AKT抗體均購自Abcam公司。

1.3細胞培養(yǎng)與轉染 將T98G、H4、U251和U87細胞接種到6孔板中，置于37℃、5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)，至狀態(tài)良好、密度約60%時將每種細胞系均各分為四組：①cells only組：不轉染；②cells + miR-control組：對細胞系轉染miR-control；③cells + miR-138 mimic組：對細胞系轉染miR-138 mimic；④cells + miR-138 inhibitor組：對細胞系轉染miR-138 inhibitor。轉染操作按照轉染試劑說明書完成，轉染6 h后更換培養(yǎng)基。

1.4RT-PCR檢測miR-138和PDK1的mRNA水平 收獲細胞，用Trizol法抽提總RNA，分光光度法進行定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用反轉錄試劑盒獲得cDNA，根據(jù)SYBR GREEN試劑盒進行RT-PCR實驗，其中miR-138的RNA的提取用小RNA提取試劑盒、cDNA的獲得用加尾法miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、檢測用miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒。用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。引物設計為miR-138上游引物5′-TGTGAATCAGGCCGTTGC-3′，下游引物5′-GCCCTGGTGTTGTGAAGTAG-3′，PDK1上游引物5′-ACCTTTGGGCTCTTGGAT-3′，下游引物5′-TATGTTGCTGCCTGACCT-3′，內參GAPDH上游引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，上述引物核對無誤后交由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.5MTT檢測miR-138對細胞系增殖的影響 在6孔板中分別培養(yǎng)T98G、H4、U251和U87細胞，至狀態(tài)良好、密度約60%時，分組同1.3，轉染操作按照轉染試劑說明書完成，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)一段時間，每孔加入5 mg/L的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸盡培養(yǎng)液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，吸盡余液，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，在37℃恒溫搖床上溫和震蕩10 min，上酶聯(lián)免疫檢測儀，570 nm波長處讀取OD值。

1.6Western印跡檢測AKT信號通路的激活 收獲細胞，用十二烷基硫酸鈉(SDS)結合緩沖液處理蛋白樣品，處理好的蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，電泳結束后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%牛血清白蛋白(BSA)在4℃封閉過夜，洗滌后37℃敷一抗1 h，再洗滌3次，在37℃敷二抗30 min，洗滌后顯影。

1.7統(tǒng)計學分析 采用Graphpad prism6軟件進行t檢驗、方差分析、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1miR-138和PDK1在GBM中上調 膠質母細胞瘤組mir-138表達水平(1.712±0.230)顯著高于低級別膠質瘤組(1.117±0.044)和非瘤組(1.001±0.067，P<0.05)，膠質母細胞瘤組PDK1水平(1.896±0.147)顯著高于非瘤組(0.995±0.056，P<0.05)，而與低級別膠質瘤組(1.853±0.101)無顯著差異(P>0.05)。膠質母細胞瘤患者中miR-138的水平與PDK1的水平呈正相關(r=0.782 1，P<0.05)。

2.2miR-138在GBM細胞系中促進PDK1的表達 轉染miR-138 mimic后PDK1的表達水平上升，轉染miR-138 inhibitor后PDK1的表達水平降低(均P<0.05)，表明miR-138可促進PDK1表達，見表1。miR-138和PDK1存在可互補結合的序列，見圖1。

表1 T98G、H4、U251和U87細胞系中PDK1的表達

圖1 Targetscan分析miR-138的靶基因(A和B)

2.3PDK1促進GBM細胞系增殖 轉染miR-138 mimic促進T98G、H4、U251和U87細胞的增殖，轉染miR-138 inhibitor抑制T98G、H4、U251和U87細胞的增殖(均P<0.05)，表明miR-138可促進GBM細胞系的增殖，見表2。

表2 T98G、H4、U251、U87細胞增殖

2.4miR-138激活AKT通路 轉染miR-138 mimic后T98G細胞的PDK1和pAKT蛋白水平顯著增高，轉染miR-138 inhibitor后T98G細胞的PDK1和pAKT蛋白水平顯著降低(均P<0.05)，表明miR-138可促進PDK1表達，并促進AKT磷酸化，即miR-138可激活AKT 通路，見表3、圖2。

表3 各組AKT、pAKT和PDK1蛋白水平比較

1～4：cells only組;cells+miR-control組;cells+miR-138 inhibitor組;cells+miR-138 mimic組圖2 Western印跡檢測AKT、pAKT和PDK1的蛋白水平

3 討 論

GBM是膠質瘤中惡性程度最高的〔11〕，接受全面治療的GBM患者的中位生存時間僅為1年〔12〕。研究表明miRNA在GBM的發(fā)病和發(fā)展中扮演了重要角色〔13～16〕，本研究結果表明miR-138可能與膠質瘤惡性程度有關，PDK1可能是miR-138的靶基因，而GBM患者顱內高水平的miR-138可能能對其靶基因發(fā)揮更強的調節(jié)功能，從而對GBM的病理變化發(fā)揮更多的影響。研究報道m(xù)iR-504可通過負向調節(jié)Wnt信號通路來抑制間葉細胞型GBM瘤細胞的侵襲和遷移〔17〕，miR-940可抑制GBM瘤細胞的增殖和細胞周期的進展〔18〕，本研究結果表明miR-138可促進AKT的磷酸化，即能激活AKT信號通路，AKT信號通路活化對細胞的影響結果之一就是細胞增殖〔19，20〕。