IQGAP2抑制結腸癌細胞侵襲且通過啟動子異常甲基化致基因沉默

許晶 金紅花 金順花

(延邊大學附屬醫院 1消化內科，吉林 延吉 133000;2藥學部)

我國結腸癌發病率已居第3位，抑癌基因的異常甲基化導致基因失活與腫瘤發生、發展密切相關。IQGAPs是含IQ模序的GTP酶活化蛋白,到目前為止已發現IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3 3個亞族。其中IQGAP1是Rho家族GTP酶成員Rac1和細胞分裂周期蛋白(CDC)42的一個重要效應因子，在細胞黏附、細胞骨架、極性、遷移及腫瘤侵襲、轉移過程中起關鍵作用。研究顯示〔1～3〕，在肺癌、肝癌和結直腸癌中均可見IQGAP1的高表達，IQGAP1是一種癌基因，且增強膠質瘤、甲狀腺癌和結腸癌細胞的侵襲能力〔4～6〕。IQGAP2是一種抑癌基因〔7〕，IQGAP2和IQGAP1在結構、功能上即有相似之處，又有明顯不同。兩者在肝細胞癌中的表達及作用也截然相反〔8〕。目前，關于IQGAP2基因甲基化及其對結腸癌細胞侵襲作用的研究甚少。本研究探討在結腸癌細胞系中IQGAP2是否通過基因甲基化引起沉默及IQGAP2對結腸癌細胞侵襲作用的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 人結腸癌RKO細胞株由日本東京醫科齒科大學分子腫瘤醫學饋贈；培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；pcDNA4.0A質粒試劑盒和脂質體(Lipofectin TM2000)均購自美國Genecopoeia公司；IQGAP2鼠抗人單克隆抗體、β-actin鼠抗人單克隆抗體均購自美國Abcam公司。提取RNA試劑盒、提取DNA試劑盒、Matrigel膠試劑盒均購自美國Invitrogen 公司。

1.2細胞培養 人結腸癌RKO細胞株用10%小牛血清的最低基本培養基(MEM)培養液，在37℃、5%CO2且飽和濕度培養箱中進行培養，隔天換液，待細胞生長至約80%融合時，用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)混合消化液分散成單細胞，傳代培養，取對數生長期的細胞進行實驗。用5 μmol/L脫甲基化試劑5-aza-2′-deoxycytidine處理48 h。

1.3細胞轉染 構建增強IQGAP2表達的pcDNA4.0A-IQGAP2質粒，制備感受態細菌，轉化，提取質粒，經酶切和測序鑒定正確后，純化并回收質粒。構建pcDNA4.0A-IQGAP2質粒方案：IQGAP2引物序列：5′-TGCATGAGAAAGGTGTCCTG-3′(正義);5′-GGCACCTGGGTACATTCTTC-3′(反義)，PCR擴增、其產物純化，單鏈兩端包含護堿基和NotⅠ和HindⅢ酶切殘基，能直接與經NotⅠ和HindⅢ酶切的pcDNA4.0A連接。脂質體(Lipofection TM2000)介導，轉染經zeocin選擇、克隆穩定增強IQGAP2表達的人結腸癌RKO細胞株。用逆轉錄PCR，Western印跡法，檢測其IQGAP2抑制或增強效果。

1.4RT-PCR 采用Trizol法提取總RNA，進行反轉錄。PCR上游引物：5′-TGCATGAGAAAGGTGTCCTG-3′，下游引物5′-GGCACCTGGGTACATTCTTC-3′，PCR條件：94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環，最后72℃ 10 min。

1.5IQGAP2甲基化的特異性PCR(MSP) 采用Trizol(美國Invitrogen 公司)法提取DNA，使用紫外分光光度計測定DNA濃度，將5 μg DNA用bisulfite處理修飾，而后使用Wizard DNA Clean-up System A7280(Promega公司)進行脫鹽、純化回收，PCR擴增。IQGAP2甲基化特異性(M)上游引物：5′-GGAGTGGGTCGTAGATTTTCGGGC-3′，下游引物：5′-CTACCCTCGCTAACCAAACTCGCG-3′，IQGAP2非甲基化特異性(U)上游引物：5′-AGGGAGTGGGTTGTAGATTTTTGGGT-3′，下游引物：5′-CAACTACCCTCACTAACCAAACTCACA-3′。PCR條件：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環。

1.6IQGAP2甲基化測序 DNA提取物使用亞硫酸氫鹽(Bisulfite)修飾基因組DNA，設計引物進行PCR擴增，PCR產物克隆測序，定量分析每個CpG島甲基化情況。PCR上游引物：5′-GTTATTTTTAGGTTATTAGTTGTG-3′，下游引物：5′-ACAACTCTTCRTATAACATCCTAC-3′。PCR條件：95℃ 5 min， 之后95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環，延伸 72℃ 10 min。

1.7Western印跡 收集瞬時轉染72 h后的細胞，常規提取細胞蛋白，取50 μg蛋白質以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，恒壓100 V電轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，分別加入IQGAP2(1∶1 000)和辣根過氧化物酶(HRP)標記的β-actin內參照抗體，4℃溫育過夜。次日用TBST洗膜3次，每次10 min，用HRP標記的羊抗兔二抗(1∶4 000稀釋)溫育1 h。用電化學發光(ECL)發光劑顯示陽性條帶。使用GE公司的Typhoon9400分子成像系統檢測和分析結果。

1.8Transwell侵襲實驗 實驗前1 d將基質膠置4℃融化過夜，用無血清培養基1∶4稀釋，加入稀釋好的40 μl基質膠于Transwell小室中，置37℃培養箱中溫育4 h，上室加入300 μl含3×103個細胞的無血清培養基，下室加入含有30%胎牛血清完全培養基600 μl。置37℃、5%CO2培養箱溫育48 h后，用棉簽擦去上室中未遷移細胞，4%多聚甲醛固定15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，結晶紫染色15 min，清水洗滌，空氣風干。實驗重復3次，取平均值。

1.9統計學分析 采用 SPSS21.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1在結腸癌細胞中IQGAP2基因的甲基化水平 人結腸癌RKO細胞株采用RT-PCR擴增，發現IQGAP2基因完全不表達，經5-aza-2′-deoxycytidine處理，IQGAP2基因表達明顯增強，見圖1。利用MSP檢測IQGAP2基因甲基化，可見甲基化引物擴增條帶(M)，未見非甲基化引物擴增條帶(U)，見圖1。采用Western印跡法，發現人結腸癌RKO細胞株中，IQGAP2蛋白表達丟失。

圖1 在結腸癌細胞系中IQGAP2的甲基化

2.2在結腸癌細胞中IQGAP2甲基化測序 DNA提取物使用Bisulfite修飾基因組DNA，PCR擴增，PCR產物克隆測序，定量分析每個CpG島甲基化，發現IQGAP2基因啟動子存在高甲基化，見圖2。

圖2 在結腸癌細胞中IQGAP2甲基化測序

2.3IQGAP2抑制結腸癌細胞的侵襲能力 利用IQGAP2蛋白完全不表達的人結腸癌RKO細胞株，轉染pcDNA4.0A-IQGAP2質粒，增強了IQGAP2蛋白表達。通過Transwell實驗檢測侵襲能力，發現轉染pcDNA4.0A-IQGAP2質粒組的PKO細胞侵襲率(70%)顯著低于對照組(21%，P<0.001)，抑制了結腸癌細胞的侵襲能力，見圖3。

圖3 IQGAP2抑制結腸癌細胞的侵襲能力

3 討 論

基因甲基化是基因失活的主要機制之一，抑癌基因失活與腫瘤發生、發展關系密切。DNA甲基化作為轉錄水平的DNA修飾方式，是一種重要的基因表達調節機制，在許多生物學過程中扮演著重要角色，包括胚胎發育、遺傳印跡、細胞分化和腫瘤發生、發展等。DNA異常甲基化與抑癌基因失活〔9〕，基因表達丟失關系密切。

IQGAPs是腫瘤發生、轉移復發的關鍵調控分子。在 IQGAPs的3個亞族中，IQGAP1研究較多，IQGAP2和IQGAP3研究較少。研究顯示〔10〕，IQGAP1是一種癌基因，而IQGAP2是一種抑癌基因。IQGAP2有62%與IQGAP1同源。IQGAP1與E-鈣黏蛋白(Cadherin)〔11〕、β-連環蛋白(Catenin)、鈣離子(Ca2+)/鈣調蛋白(Calmodulin)、RAF、絲裂原活化蛋白激酶(MEK)1/2、細胞外信號調節激酶(ERK)1/2〔12〕、CDC42、Rac1〔13〕等眾多靶分子相互作用，促進腫瘤發生。文獻報道〔14〕，IQGAP1增強乳腺癌的侵襲能力，而Jin等〔15〕在國內外首次發現IQGAP2甲基化引起基因沉默，IQGAP2降低胃癌細胞侵襲能力，并與侵襲深度、預后不良有關。IQGAP3是一種癌基因，IQGAP2的低表達和IQGAP3的高表達與惡性腫瘤的預后有關〔16〕。

綜上，IQGAP2是惡性腫瘤的重要抑癌基因，在胃癌和結腸癌中，IQGAP2甲基化引起基因沉默，增強IQGAP2表達，癌細胞侵襲能力明顯下降，提示IQGAP2與腫瘤侵襲密切相關。因此，在消化道腫瘤中，值得深入研究IQGAP2調控癌細胞侵襲、轉移機制及去甲基化治療的臨床意義。