8個靈芝菌株農藝性狀、產量及有效成分比較分析*

盛立柱，謝良明，葉曉菊，何建芬，廖加貴，文冬華，林火松

（1.龍泉市食藥用菌產業辦公室，浙江 龍泉 323700；2.龍泉市張良明菌種場，浙江 龍泉 323700；3.龍泉市麗佳食用菌菌棒專業合作社，浙江 龍泉 323700）

靈芝（Ganoderma lingzhi）俗稱靈芝草、仙草、瑞草等[1]，隸屬于真菌門（Mycobionta） 擔子菌綱（Ba sidiomycetes） 多孔菌目 （Polyporales） 靈芝科（Ganodermataceae） 靈芝屬（Ganoderma）。靈芝是著名的食（藥）用真菌，藥用歷史已有2 000多年，因具有多種藥用價值而被歷代醫藥學家視為滋補壯體、扶正固本的神奇珍品[2]。

我國靈芝栽培主要有2種模式，一種是段木靈芝栽培，另一種是代料靈芝栽培，目前以段木栽培為主，產地主要有浙江、安徽、福建、東北、四川、貴州等地[3]。段木靈芝栽培需要消耗大量的木材，且生長周期較長，耗時耗力，栽培過程需要覆土，隨著栽培年限的積累，土壤栽培環境不斷變化，靈芝栽培出現連作障礙，因此段木靈芝栽培需要每2年更換一次栽培場地，無形中增加了生產成本。靈芝代料栽培主要分布在華北地區，其模式已經十分普遍，但總體上我國靈芝的代料栽培多數采用分散式、手工式栽培模式，各地區生產水平不同，生產方式粗放，設施相對簡陋，生產規模小，品質參差不齊，經濟效益低[4]。

靈芝的藥用價值來自其孢子粉，近年來研究表明靈芝的主要生理活性成分有靈芝多糖、三萜類化合物、蛋白質、多肽、核苷類、呋喃類、甾醇、生物堿和氨基酸等，而靈芝多糖和三萜類化合物是靈芝孢子粉的重要有效成分[5]，不同靈芝品種中靈芝多糖和三萜含量不同，相同品種在不同栽培基質中的靈芝多糖和三萜含量差異較大[6]。因此靈芝孢子粉的產量以及孢子粉中多糖和三萜類化合物的含量成為評價靈芝品種優劣的重要指標[7]。

隨著大健康產業的不斷發展，靈芝栽培技術的不斷提升，以及對靈芝產品更深層次的開發利用，消費者對靈芝功效的認可度也逐漸提升，需求量日益增加。傳統的分散式、手工式栽培模式已經無法滿足市場的需求，故靈芝工廠化栽培是靈芝產業發展的新方向。靈芝工廠化栽培采用代料栽培模式，根據靈芝的適宜生長條件，采用數字化智能系統實時監測和調控栽培環境條件，大批量、多批次地生產靈芝。避免靈芝栽培受季節、環境因素的影響，解決重金屬殘留、靈芝栽培連作障礙等問題。合理利用森林資源，滿足更大的市場需求，實現全年無間歇、高品質、高產能的靈芝生產。因此，通過試驗篩選出適宜的靈芝代料栽培菌株品種，為靈芝工廠化栽培提供優勢菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：美芝、韓芝、日芝、角芝、泰山、113、X16、滬農1號共8個菌株，均來自龍泉市張良明菌種場。

菌袋：原種和栽培種菌袋為15 cm×29 cm×0.05 cm聚乙烯菌袋，生產菌袋為18 cm×42 cm×0.05 cm的聚乙烯菌袋。

PDA試管培養基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，水定容至1 L。

原種和栽培種培養料配方：木屑80%、棉籽殼10%、麩皮8.5%、石膏粉1%、紅糖0.5%，水60%～65%。

生產栽培配方：木屑88.5%、麩皮10%、石膏粉1%、紅糖0.5%，水60%～65%，每袋干重0.7 kg～0.8 kg。

栽培場所：標準化鋼架養菌大棚。

試驗儀器：SE602FZH分析天平，奧豪斯國際貿易上海有限公司；UV1102Ⅱ759分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；DK-S24電熱水浴鍋，上海森信試驗儀器有限公司；JY92-IIN超聲儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；VELOCITY 14R離心機，廣州碩譜生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 母種的制備

制作PDA試管培養基50支，121℃高壓滅菌30 min后制成試管斜面。隨機抽取5支滅菌后的試管，放入恒溫培養箱內25℃空培養48 h，觀察試管是否有雜菌污染，未污染方可使用。每個供試菌株在無菌環境下各接種3支試管，標記好標簽，放入恒溫培養箱內25℃培養，隨時觀察菌絲體顏色變化情況，及時觀察雜菌污染情況。待菌絲長到試管斜面2/3，轉接原種。

1.2.2 原種的制備

將配制好的原種培養料裝入原種菌袋內，封口后121℃高壓滅菌，待溫度升至121℃后保溫2.5 h，冷卻降溫至約28℃進行接種。挑選菌絲體潔白濃密的母種試管，每支供試菌株的母種試管分別挑取直徑為0.5 cm的菌塊，分別接種到4個原種菌袋，標記好標簽，于25℃室內層架培養，待原種長滿菌袋后，方可接種栽培種。

1.2.3 栽培種的制備

將配制好的栽培種培養料裝入栽培種菌袋內，封口后于121℃高壓滅菌，待溫度升至121℃后保溫2.5 h。冷卻降溫至約28℃后在無菌環境下接種，每個原種菌袋約可接種40個栽培種菌袋。每個供試菌株接種12個栽培種菌袋，標記好標簽，后放置于培養室內層架培養并觀察栽培種菌絲生長狀態，隨時取出污染的栽培種菌袋。

1.2.4 生產菌包的制備

將配制好的生產栽培配方裝入生產菌袋內，于121℃高壓滅菌，待溫度升至121℃后保溫2.5 h，冷卻降溫至約28℃后可接種。每袋栽培種約可接種40個生產菌袋，每個菌株設計3個試驗重復，每個重復90袋，標記好標簽，放置于培養室內層架培養，溫度控制在22℃～25℃，濕度控制在60%～65%。

1.2.5 菌絲生長狀態和菌包成活率統計

每天觀察一次菌絲生長狀態，隨時剔除污染菌包。記錄每個菌株菌絲生長情況、發菌天數、成活率等。

1.2.6 出芝管理及試驗數據采集記錄

栽培場所提前用生石灰消毒，大棚頂部用次氯酸鈉消毒，并通風晾曬3 d，將發滿菌的生產菌包放置于標準鋼架大棚內，每個供試菌株的生產菌包分區塊放置，并做好試驗標記。出芝過程進行光照、水分、通風、降溫等管理，每天早、晚各噴水1次，高溫時不噴水。子實體原基形成后，及時進行疏蕾，每袋保留生長力較強的1個原基。

子實體分化期要保持空氣濕度在80%～85%，加強通風管理。靈芝菌蓋邊緣的白色消失，開始套筒收集孢子粉，孢子粉收集結束的依據是菌蓋背面顏色變深，則收集孢子粉結束，記錄采收時長并取下套筒，將孢子粉統一回收至干凈的器具內。同時觀察記錄各菌株農藝性狀、高溫爛棒率，并記錄各個菌株孢子粉及子實體產量。選取孢子粉產量較高的菌株，進行孢子粉中靈芝多糖和三萜含量的測定，做好數據統計。

1.2.7 靈芝三萜和多糖含量的測定

靈芝孢子粉用乙醇加熱回流并超聲破壁，采用齊墩果酸作為對照品，經香草醛-高氯酸溶液顯色后做全波長測定，以此計算樣品中三萜含量。具體試驗步驟如下。

精密稱取烘干的樣品0.5 g，用95%的乙醇浸泡所有樣品并定容至50 mL，超聲提取2 h，期間經常搖動，于離心機中4 000 r·min-1離心10 min，取上清液備用。精密吸取齊墩果酸標準溶液0、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL 于各 10 mL 具塞試管中，加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.5 mL，混勻后加塞，置60℃水浴恒溫加熱20 min，取出后迅速冷卻，再加入5 mL的冰醋酸，混勻后于550 nm處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標，齊墩果酸質量為橫坐標作圖，得標準曲線。精密吸取樣品溶液1.0 mL置于試管中，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL及高氯酸1.2 mL后，按照齊墩果酸對照品溶液處理方法處理，于550 nm處測定吸光度值。靈芝三萜含量（W，%）的計算公式如下：

式中：c為從標準曲線上查得樣品分解的三萜含量（μg）；v1為樣品定容體積（mL）；m為樣品的質量（g）；v2為比色測定時所移取試樣分解液的體積 （mL）。

粗多糖采用SN/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測定[8]中的方法測定。

1.3 數據分析

每個菌株設置3個試驗重復，結果以平均值±標準差表示，試驗數據用SPSS軟件進行數據分析，采用ANOVA單因子方差分析，P＜0.05作為評判顯著性標準。

2 結果與分析

2.1 菌絲生長速度和農藝性狀

8個供試菌株的菌絲長勢和農藝性狀見表1。

表1 8個靈芝菌株生長情況Tab.1 Growth situation of eight strains of Ganoderma lingzhi

從表1可以看出，8個靈芝菌株菌絲長勢均較強，其中日芝和韓芝菌絲長勢比其他幾個菌株菌絲長勢稍弱，其他6個菌株菌絲長勢均強。

8個菌株菌絲體形態特征均呈現出菌絲潔白、濃密，生長較快。比較菌絲滿袋天數發現，美芝的菌絲生長速度最快，50 d長滿菌袋，其次為滬農1號、113、X16、角芝、泰山，60 d長滿菌袋，日芝、韓芝菌絲生長速度最慢，65 d長滿菌袋。8個菌株接種成活率較高，均為99%以上。8個供試菌株中日芝和泰山覆土栽培后高溫爛棒率較高，分別為15%和10%；韓芝、美芝爛棒率最低為2%；其余菌株（角芝、113、X16、滬農1號） 高溫爛棒率為5%。8個菌株現蕾時間不一，美芝排場后現蕾最快，9 d開始現蕾；滬農1號和X16需12 d現蕾；角芝13 d現蕾；泰山15 d現蕾，日芝、韓芝和113需17 d現蕾。排場后待菌蓋邊緣黃色褪去，即套筒準備采收靈芝孢子粉，美芝開始產粉所需時間最短，排場后30 d即開始產粉；角芝排場后37 d開始產粉；韓芝排場后43 d開始產粉；泰山排場后47 d開始產粉；113排場后48 d開始產粉；X16和日芝排場后49 d開始產粉；滬農1號開始產粉所需時間最長，排場后51 d開始產粉。韓芝采收時長最長，從開始采收到采收結束需40 d，113菌株采收孢子粉33 d，其余6個育粉菌株采收孢子粉均需30 d。

8個靈芝菌株子實體的菌蓋直徑與菌柄長度記錄見表2。

表2 8個靈芝菌株子實體農藝性狀Tab.2 Agronomic characters of fruit bodies of eight strains of Ganoderma lingzhi

從表2中可知，8個供試菌株菌蓋直徑從大到小依次為：美芝＞韓芝＞X16＞角芝≈滬農1號＞泰山＞113≈日芝；8個菌株菌蓋直徑差異均不顯著，菌蓋直徑為11.54 cm～13.53 cm，美芝菌蓋直徑最大，113、日芝菌蓋直徑最小。8個供試菌株中菌柄長度依次為：滬農1號＞113＞X16＞角芝＞日芝＞韓芝＞泰山＞美芝；其中滬農1號菌柄長度最長，與113、X16菌柄平均長度差異不顯著，與角芝、日芝、韓芝、泰山、美芝差異顯著；美芝菌柄長度最短，與韓芝、泰山菌柄平均長度差異不顯著，與滬農1號、113、X16、角芝、日芝差異顯著。記錄子實體形態特征發現，113朵形偏小，滬農1號朵形均勻，日芝朵形欠圓且大小不均，其余菌株朵形均圓整；8個菌株只有美芝菌蓋顏色正面呈紅褐色，背面呈灰色，其余7個菌株均菌蓋顏色正面呈褐色，背面呈淡黃色。

2.2 孢子粉和子實體平均產量

按90袋菌袋的總量計，8個供試靈芝菌株的孢子粉和子實體平均產量見表3。

表3 8個靈芝菌株孢子粉和子實體平均產量Tab.3 Average yield of spore powder and fruit body of eight strains of Ganoderma lingzhi

由表3可知，供試的8個菌株中，孢子粉平均產量從高到低依次是：美芝＞角芝＞滬農1號＞X16＞113＞韓芝＞泰山＞日芝。其中美芝孢子粉平均產量最高，與角芝、滬農1號、X16、113差異不顯著，與韓芝、泰山、日芝差異顯著，日芝孢子粉平均產量最低，與泰山差異不顯著，與其他菌株差異顯著；韓芝與其他7個菌株孢子粉產量差異均顯著。子實體平均產量從高到低依次為：韓芝＞日芝＞泰山＞113＞X16＞滬農1號＞角芝＞美芝。其中韓芝子實體平均產量最高，與美芝子實體平均產量差異顯著，與其他6個菌株子實體平均產量差異不顯著；美芝子實體平均產量最低，與其他7個菌株子實體平均產量均差異顯著。

2.3 三萜和多糖含量

對8個靈芝菌株的孢子粉三萜含量和多糖含量進行檢測，結果見表4。

表4 8個靈芝菌株孢子粉活性成分Tab.4 Active ingredient in spore powder of Ganoderma lingzhi

從表4可知，孢子粉中三萜含量由高到低依次為：滬農1號＞113≈美芝＞X16＞韓芝＞泰山＞角芝≈日芝。其中滬農1號孢子粉中三萜含量最高，與113、美芝、X16、韓芝差異不顯著，與泰山、角芝日芝差異顯著；角芝和日芝孢子粉中三萜含量最低，角芝與日芝、X16、韓芝和泰山間差異不顯著，與滬農1號、美芝差異顯著；日芝與X16、韓芝、泰山、角芝差異不顯著，與滬農1號、113和美芝差異顯著。孢子粉中多糖含量從高到低依次為：113＞滬農1號＞美芝＞韓芝＞X16＞角芝≈日芝＞泰山。其中113孢子粉多糖含量最高，與其他7個菌株孢子粉中多糖含量差異顯著；其次是滬農1號，與美芝、韓芝、X16孢子粉中多糖含量差異不顯著，與角芝、日芝、泰山、113差異顯著；泰山孢子粉中多糖含量最低，與X16、角芝、日芝差異不顯著，與113、滬農1號、美芝、韓芝差異顯著。

3 討論

目前科研工作者主要是用農藝性狀或采用分子標記法和同工酶的方法來篩選和評價菌株[9-10]，而分子標記和同工酶的分子化學方法比較費時[11]。因此試驗觀察了8個靈芝菌株的菌絲長勢及菌絲體形態特征，量化了多個靈芝菌株的農藝性狀，對其孢子粉和子實體產量進行統計分析，并進一步對孢子粉中的三萜和靈芝多糖進行了含量測定。從試驗結果中可以總結出美芝的菌絲生長速度最快、高溫爛棒率低、現蕾及產粉時間短，從下田排場到孢子粉采收結束僅需要69 d，比其他育粉靈芝菌株中最快的角芝快11 d，比最慢的韓芝快31 d，美芝作為工廠化育粉靈芝菌株，其生產周期占絕對優勢，且孢子粉中三萜和多糖含量均僅次于滬農1號和113。角芝菌絲生長速度、高溫爛棒率以及從現蕾到孢子粉采收結束時間僅次于美芝，比美芝慢11 d，孢子粉產量也僅次于美芝。

從各菌株的子實體產量結果分析中可以看出，孢子粉產量低的菌株子實體產量均較高，相反孢子粉產量高的角芝、美芝子實體產量均較低，輔助證明這2個菌株的生物轉化率較高。因此，美芝和角芝均符合工廠化生產對菌株生產周期短、產量高、品質優的條件要求。滬農1號和菌株113，雖然從現蕾到孢子粉采收時間均在90 d以上，但滬農1號孢子粉中三萜含量最高，除與美芝的孢子粉三萜含量差異不顯著外，與其余菌株均有顯著差異，113孢子粉中多糖含量最高，且與其他菌株的差異均顯著，因此滬農1號和菌株113也可作為工廠化育粉靈芝栽培備選菌株。

工廠化靈芝栽培，具有不與人爭糧、不與糧爭地、不與地爭肥、不與農爭時、不與其他行業爭資源的優勢，且栽培環境清潔，全程采用標準化管理，數字化操作，可避免孢子粉及子實體中農藥殘留及重金屬污染，提高靈芝生產質量安全，實現靈芝標準化生產。工廠化靈芝栽培除可彌補棚式代料栽培的不足之外，選用雜木屑作為培養料，可減少森林資源的過度消耗，維持生態環境健康可持續發展。

通過農藝性狀結合孢子粉和子實體產量以及孢子粉中的主要活性成分的分析，為靈芝工廠化栽培篩選出較適合菌株，為未來的靈芝產業向工廠化、現代化、高標準、高品質、健康綠色發展提供優良菌株。但對篩選出的育粉靈芝優勢菌株，在工廠化更精準的控溫養菌、控溫出芝等條件下農藝性狀以及孢子粉中三萜和靈芝多糖含量是否會有進一步提升，還需探索研究。