羊肚菌母種培養基及培養條件優化研究*

趙航軻，陳 杭，馬 薇，羊玉蓉，降初拉爾布，唐 瑤，劉良珍，唐明先

（甘孜州農業科學研究所，四川 康定 626000）

羊肚菌（Morchella spp.）隸屬于子囊菌亞門（Ascomycota） 盤菌綱 （Discomycetes） 盤菌目 （Pezizales） 羊肚菌科 （Morchellaceae） 羊肚菌屬（Morchella）[1-3]，是世界四大珍貴食用菌之一。富含19種氨基酸，其中9種為人體必需氨基酸，約占氨基酸總含量的40%[4]，同時含有39.7%的碳水化合物及24.5%的蛋白質，具有較高的營養價值[5]。此外，研究發現羊肚菌多糖和蛋白質[6]具有抗腫瘤、免疫調節、抗氧化和降低膽固醇等藥用活性[7-9]，對抗腫瘤藥物的研究與開發具有重要意義[10-11]。

羊肚菌母種退化是導致其栽培時抗逆性差、產量低、品質差的重要原因。2018年～2020年，甘孜州羊肚菌栽培面積迅速擴大到2 000 hm2，獲得巨大經濟效益，在扶貧攻堅中發揮較大作用。近年來甘孜州部分農戶采用自己制備的羊肚菌菌種，不僅因為技術和經驗不足，同時更因母種自帶雜菌，且營養條件和培養條件不適合菌絲生長和保存，出現了種源混亂、抗逆性差、新型病蟲害增多、品質參差不齊、產量差異明顯等問題，給菇農造成了巨大損失。若要羊肚菌產業健康發展，必須保障優良的母種。因此，對羊肚菌母種的營養及環境條件進行系統優化，為羊肚菌母種的復壯、保藏提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

六妹羊肚菌（Morchella sextelata M.Kuo） 菌株，由甘孜藏族州農業科學研究所提供。

1.1.2 培養基

基礎培養基：葡萄糖20 g、酵母粉5 g、KH2PO41 g、VB110 mg，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將保藏的羊肚菌菌種接種于固體培養基上，置于24℃恒溫培養箱培養7 d。

1.2.2 羊肚菌液體種培養基組分的優化

1） 碳源篩選

自活化菌株取0.5 cm×0.5 cm的菌塊分別接種至玉米粉、可溶性淀粉、玉米芯粉、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、甘露醇替代葡萄糖的基礎培養基中，各組分含量保持不變，播床24℃、160 r·m-1避光恒溫培養，每12小時測量菌絲生長速度，共培養1周后確定最佳碳源，篩選出最適濃度。

2） 氮源篩選

自活化菌株取0.5 cm×0.5 cm的菌塊分別接種至蛋白胨、黃豆粉、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸銨、尿素、硝酸鈣替代酵母粉的基礎培養基中，其余培養方法同碳源篩選。

3） 無機鹽篩選

自活化菌株取0.5 cm×0.5 cm的菌塊分別接種 至 FeSO4、 CaCl2、 NaCl、 K2PO4、 MgSO4·7H2O、MnSO4、K2SO4替代K2HPO4的基礎培養基中，其余方法同氮源篩選。

4） 生長因子篩選

自活化菌株取0.5 cm×0.5 cm的菌塊分別接種至VB2、VB6、VB7、吲哚乙酸、葉酸、煙酸、赤霉素替代VB1的基礎培養基中，其余方法同無機鹽源篩選。

正交法優化母種培養基組分：在單因素試驗基礎上，以最佳碳源、最佳氮源、最佳無機鹽、最佳生長因子作為4個影響羊肚菌母種培養基組分的因素，正交試驗方案見表1。

表1 母種培養基組分的正交優化試驗Tab.1 Orthogonal optimization experiment on thecompositions of medium for stock culture

1.2.3 羊肚菌液體菌種培養條件的優化

在最佳培養基基礎上選取透光率為0、20%、40%、60%、80%、100%，使用1%鹽酸和1%的氫氧化鈉溶液調節初始pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，培養溫度為 18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃，在單因素試驗基礎上采用三因素三水平正交試驗篩選出羊肚菌母種最佳培養條件。正交試驗方案見表2。

表2 母種環境條件的正交優化試驗Tab.2 Orthogonal optimization experiment of cultivation conditions for stock calture

2 結果與分析

2.1 母種培養基組分優化結果

2.1.1 母種培養基組分單因素試驗結果

最佳碳源及最佳濃度的篩選結果見圖1。

圖1 最佳碳源（A） 及最佳濃度（B） 篩選Fig.1 Screening of optimal carbon source(A)and optimal concentration(B)

如圖1所示，8種碳源均能促進菌絲生長，其中以可溶性淀粉為唯一碳源時，菌絲生長速度最快（P＜0.05），為 0.83 cm·d-1，且菌絲致密、粗壯、有活力。因此確定可溶性淀粉為最佳碳源，最佳濃度為 20 g·L-1。

最佳氮源及最佳濃度的篩選結果見圖2。

圖2 最佳氮源（A） 及最佳濃度（B） 篩選Fig.2 Screening of optimal nitrogen source(A)and concentration(B)

如圖2所示，8種氮源均能促進菌絲生長，其中以蛋白胨為唯一氮源時，菌絲生長速度最快（P＜0.05），為0.76 cm·d-1，所以確定蛋白胨為最佳氮源，最佳濃度為5 g·L-1。

最佳無機鹽及其添加濃度的篩選結果見圖3。

圖3 最佳無機鹽（A）及最佳濃度（B）篩選Fig.3 Screening of optimal inorganic salt(A)and optimal concentration(B)

如圖3所示，8種無機鹽均能促進菌絲生長，其中以KH2PO4為唯一無機鹽時，菌絲生長速度最快（P＜0.05），為 0.65 cm·d-1，所以確 KH2PO4為最佳無機鹽，最佳濃度為1.5 g·L-1。

最佳生長因子及其添加濃度的篩選結果見圖4。

圖4 最佳生長因子（A）及最佳濃度（B）篩選Fig.4 Screening of optimal growth factor(A)and optimal concentration(B)

如圖4所示，8種生長因子均能促進菌絲生長，其中以葉酸為唯一生長因子時，菌絲生長速度最快（P＜0.05），為 0.61 cm·d-1，因此確定葉酸為最佳生長因子，最佳濃度為10 mg·L-1。

2.1.2 母種培養基組分正交試驗

選擇單因素試驗最佳碳源可溶性淀粉、最佳氮元蛋白胨、最佳無機鹽KH2PO4、最佳生長因子葉酸進行正交試驗優化分析，優化結果見表3。

表3 母種培養基組分的正交試驗優化結果Tab.3 Orthogonal experimental optimization results of the medium compositions for stock culfure

由表3極差R值可知，可溶性淀粉、蛋白胨、KH2PO4、葉酸4個因素對羊肚菌菌絲生長速度的影響主次順序為：蛋白胨>可溶性淀粉>KH2PO4>葉酸（B>A>C>D）。正交試驗表明，羊肚菌菌絲生長的最佳培養基為：A2B2C3D2（可溶性淀粉20 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、葉酸10 mg·L-1）。同時對正交結果進行方差分析，結果見表4。

表4 母種培養基組分正交試驗方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal test of medium compositions for stock culture

由表4可知，4個影響因素中，可溶性淀粉、蛋白胨、KH2PO4均達到極顯著水平，生長因子影響不顯著，即其對菌絲生長速度的影響順序為：蛋白胨>可溶性淀粉>KH2PO4>葉酸（B>A>C>D）。其中氮源影響最大，與極差分析結果基本一致，因此確定母種最佳培養基配方為：可溶性淀粉20 g·L-1，蛋白胨 5 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，葉酸 10 mg·L-1。

2.1.3 驗證試驗結果

為檢驗培養基優化工藝的可信度，結合實際試驗操作的可行性，采用最優培養基組合為可溶性淀粉 20 g·L-1、蛋白胨 5 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、葉酸10 m g·L-1，進行5次驗證試驗，得到羊肚菌菌絲平均生長速度的驗證值為（1.54±0.05） cm·d-1。該結果明確了利用正交試驗法優化羊肚菌母種培養基的最佳工藝是有效可行的。

2.2 母種培養條件優化結果

2.2.1 母種培養條件單因素試驗結果

母種培養基培養條件優化結果見圖5。

圖5 培養條件單因素試驗篩選Fig.5 Single factor test screening of cultivation conditions

由圖5A可知，在透光率為0～20%的條件下菌絲生長速度不斷增加。當透光率為20%時，菌絲生長速度達到最大，為1.24 cm·d-1；在透光率為20%～100%時菌絲生長速度緩慢下降。因此，最優透光率初步確定為20%。

母種培養基pH優化結果見圖5B。由圖5B可知，初始pH為5.5～6.5時菌絲生長速度不斷增加；當pH為6.5時，生長速度達到最大，為1.35 cm·d-1；pH為6.5～8.5時菌絲生長速度緩慢下降。因此，最佳母種培養基pH確定為6.5。

母種培養基培養溫度優化結果見圖5C。由圖5C可知，在20℃～24℃時，隨著溫度的上升菌絲生長速度不斷增加；當溫度為24℃時，生長速度達到最大，為1.32 cm·d-1，在24℃～28℃條件下菌絲生長速度緩慢下降。因此，培養溫度初步確定為24℃。

2.2.2 母種培養條件正交試驗

由母種培養基單因素試驗最佳條件所設計的母種培養基培養條件正交試驗結果見表5。

表5 母種培養條件正交試驗結果Tab.5 Results of orthogonal test on cultivation conditions for stock culture

由表5極差R值可知，可透光率、初始pH、溫度3個因素對羊肚菌菌絲生長速度影響主次順序為：透光率>初始pH>溫度（A>B>C）。正交試驗表明，能夠使菌絲生長效果最好的培養條件為：A2B2C3（透光率20%、初始pH 6.5、培養溫度26℃）。同時對正交表進行方差分析，結果見表6。

表6 母種培養條件正交試驗方差分析Tab.6 Variance analysis of orthogonal test of cultivation conditions for stock culture

由表6可知，3個影響因素中，透光率、初始pH達到極顯著水平，溫度達到顯著水平，即其對菌絲生長速度影響的大小順序為A>B>C，其中透光率影響效果最顯著，與極差分析結果基本一致。因此確定培養母種最佳環境條件為：透光率20.0%、初始pH 6.5、培養溫度26℃。

3 結論

在單因素試驗基礎上采用正交優化試驗分別對羊肚菌的母種培養基組分及培養條件進行優化，確定最佳營養條件為：可溶性淀粉20.0 g·L-1、蛋白胨5.0 g·L-1、KH2PO42.0 g·L-1、葉酸 10.0 m g·L-1；最佳母種環境條件為透光率20.0%、pH 6.5、溫度26.0℃。通過對母種營養條件及環境條件的優化，使羊肚菌菌絲在營養生殖階段初期生長速度快、發菌整齊致密、爬壁有力，為母種保藏、原種及栽培種制備提供了有力保障。