合成大麻素類新精神活性物質AB-CHMINACA的體內與體外代謝研究

李 靜，彭慧飛，花鎮東，王優美

（1.公安部禁毒情報技術中心，北京 100193； 2.中國刑事警察學院法化系，遼寧 沈陽110854）

近年來，多種合成大麻素和卡西酮類衍生物在全球范圍內被報道發現，并在世界多地引起了社會公共安全問題。新興的毒品較之前藥效更強，并多次導致死亡案例發生。 AB-CHMINACA 為吲唑-3-甲酰胺類合成大麻素類新精神活性物質，合成大麻素原體曾被發現存在固體組織，然而因合成大麻素的廣泛代謝性致其母藥在尿液中罕見，故尿液中代謝產物的鑒定對臨床和法庭科學分析起著至關重要的作用。 然而，因國內尚未進行有關其藥理學、毒理學、安全性及代謝的相關研究，給檢測吸食后尿液中的標志物帶來困難，又因開展人體體內實驗受限等客觀因素，開展體外代謝從成本及便捷性方面來講均更有利于評價其代謝產物及代謝途徑。 本研究旨在通過體外人肝微粒體模型模擬人體代謝環境，從而確定AB-CHMINACA 的I 相代謝產物，并將其結果與1 例真實濫用者的尿液樣本比對，從而確定合適的生物標志物，以進一步為臨床和法庭科學鑒定提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

戴安超高壓液相系統（Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 RSLC）串聯帶有熱電離噴霧離子化源（HESI）的 Q Exactive Plus 質譜儀。 待分析物 ABCHMINACA（CHNO：m/z 356.2212，由國家毒品實驗室繳獲物純化）。 還原型酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）再生系統溶液A5 mL，CorningGentest，NADPH 再生系統溶液B 1 mL，CorningGentest，0.1 mol·L磷酸鉀緩沖液100 mL[匯智泰康生物技術有限公司 （北京）]。混合男性肝微粒體（pHLM；蛋白質量濃度：20mg·mL）。 微粒體送達后于 37 ℃解凍、分裝并儲存于-80 ℃直至使用。

液質級乙腈（CHCN）、甲醇（CHOH）和甲酸（FA）（德國 Merck 公司）；超純水（德國 Merck 公司的Milli-Q Advantage A10 自動蒸餾水機制備）；其他所有試劑和溶劑均為分析純。

1.2 儀器工作條件

色譜柱為ACQUITY UPLCHSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫為35 ℃，樣品盤溫度為4 ℃；流動相為乙腈（B）-0.1%（體積分數，下同）甲酸溶液（A），梯度洗脫，流量和洗脫程序如下:0.0 ～7.0 min時，70%A降至40%A；7.0 ～7.2 min時，40%A降至10%A；7.2 ～9.0min時，保持10%A；9.0～9.1min 時，10%A升至70%A；9.1～12.0 min 時，保持70%A；流量持續保持在0.4 mL·min（表1）。

表1 流動相梯度洗脫程序

超高壓液相系統（Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 RSLC）串聯帶有熱電離噴霧離子化源（HESI）的 Q Exactive Plus 質譜。 儀器在使用前進行正離子模式下的質量校準。 離子源條件如下：離子傳輸毛細管溫度為350 ℃；輔氣加熱溫度為350 ℃；鞘氣流速為35 AUs；輔氣流速為10 AUs；噴霧電壓為 3.50 kV，S-透鏡RF 水平 20.0。 MS 采用正離子全掃描模式，并選取特定質荷比（m/z）的離子作為目標物進行二級子離子掃描。代謝產物的精確分子量通過軟件Thermo MetWorks 1.3 SP4.200 版本計算得出。 全掃描數據采集參數設置如下：分辨率為70 000；自動增益控制（AGC）1e；最大注入時間（IT）100ms；掃描范圍m/z70～1050。目標離子的二級參數設置如下：分辨率為17 500；目標物AGC 為1e；最大IT 為50 ms；分離窗m/z 0.6；正態碰撞能量為20%、40%、60%。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

將AB-CHMINACA溶于甲醇制備成濃度約為5 mmol·L的溶液，吸取2 μL該溶液與初始孵育反應體系混合（由20 μL 0.1 mol·L磷酸鉀緩沖液、156 μL超純水和2 μL NADPH再生系統溶液B組成），充分渦旋混合后加入10μL HLMs（pHLM；蛋白質量濃度：20 mg·mL），渦旋混勻并將其置于37 ℃環境中預孵育3 min，再加入10 μL NADPH再生系統溶液A，渦旋混勻后將其置于37 ℃環境中孵育1 h。 1 h后，加入200μL乙腈終止反應，渦旋后，以14 000 r·min離心10 min。 吸取100 μL上清液并將其轉移入玻璃進樣瓶中，置于4 ℃環境下待分析。 利用TF軟件Xcalibur Qual Browser 4.0.27.10版本進行系統控制和數據采集。

將空白溶液和未加母藥的孵育反應系統溶液作為對照同樣進行分析。同樣進行合成大麻素ABCHMINACA 在未加入微粒體的孵育體系中的穩定性研究（37 ℃，搖床1 h）以確證代謝產物由微粒體的引入而生成。

1.3.2 樣本前處理

將一例AB-CHMINACA 濫用者的尿液于-80 ℃條件下取出并解凍，吸取200 μL 該尿液并加入600μL 乙腈稀釋渦旋后，以 14 000 r·min離心 10 min。吸取100 μL 上清液并將其轉移入玻璃進樣瓶中，置于4℃環境下待分析。利用TF 軟件Xcalibur Qual Browser 4.0.27.10 版本進行系統控制和數據采集。

2 結果

AB-CHMINACA 體外代謝實驗共發現AB-CHMINACA 的 10 種體外代謝 產物 ，AB-CHMINACA 的保留時間為6.85 min，10 種代謝產物的保留時間在1.46～8.34 min 之間，檢測誤差均在 2.0 ppm 以內（圖 1～2，表 2），分別為甲酰胺水解代謝產物 1 種（M1）、酰胺水解代謝產物 1 種（M2）、N-脫烷基代謝產物1種（M3）、甲基丙基側鏈羥化代謝產物5 種（M4～M8）、環己基甲基羥化代謝產物 1 種（M9）、N-脫烷基合并甲酰胺水解代謝產物1 種（M10）。 從羥化代謝發生的位點、數目及峰面積上來看，羥化代謝反應優先發生在甲基丙基側鏈，其次是環己基甲基部分，羥化的目的是使分子極性增大，更有利于體內通過代謝后排出體外。 圖 2 為母藥 ABCHMINACA 及其所有代謝產物的提取離子峰色譜圖。 圖3 闡釋了所有代謝產物的特征碎片離子及碎裂途徑。 根據提取離子色譜峰的峰面積可知，體外代謝的主要代謝產物為甲酰胺水解代謝產物、甲基丙基側鏈羥化代謝產物、N-脫烷基代謝產物和酰胺水解代謝產物。 經提取尿液樣本中這些代謝產物的提取離子色譜圖發現，甲酰胺水解代謝產物M1、甲基丙基側鏈羥化代謝產物M4 和N-脫烷基合并甲酰胺水解代謝產物M10 在AB-CHMINACA 濫用者的尿液樣本中也均有發現。 表2 總結了人肝微粒體體外代謝孵育實驗1h 后所有代謝產物的代謝反應類型、保留時間、母離子的理論質荷比[M+H]（m/z）、實測質荷比[M+H]（m/z）、質量誤差、化學分子式、離子碎片和峰面積。 代謝產物被標記為“M”，代謝途徑如圖3 所示。

圖1 AB-CHMINACA 的體外代謝產物提取離子流色譜圖

圖2 AB-CHMINACA（A）和其代謝產物（B-G）的質譜圖、推測結構和斷裂模式

圖3 AB-CHMINACA 在人肝微粒體中的代謝途徑

表2 AB-CHMINACA 在人肝微粒體孵育1h 后的推測代謝產物

3 討論

AB-CHMINACA 的體內代謝研究結果顯示，原藥僅出現在固體組織中，在血液和尿液樣本中均未被發現。 WURITA 等報道了 8 種 AB-CHMINACA代謝產物，僅有2 種非葡醛酸結合代謝產物出現在尿液樣本中，分別為4-羥基環己基甲基代謝產物和甲酰胺水解代謝產物。本研究并未在尿液中發現4-羥基環己基甲基代謝產物，僅發現了甲酰胺水解代謝產物（表 3）。 ERRATICO 等的體外代謝研究發現，在肝微粒體體外代謝模型中，共檢測發現了7 種單羥化代謝產物、6 種雙羥化代謝產物、1 種N-脫烷基代謝產物和2 種酰胺水解代謝產物。 但在本實驗的研究中并未發現雙羥化代謝產物，單羥化代謝產物也僅發現了5 種，其他代謝產物的數量與種類均與該報道文獻一致。 結合前期相關實驗研究發現，AB-CHMINACA 濫用者的尿液樣本中代謝產物的種類存在顯著差異，數量從2 種至13 種不等，說明AB-CHMINACA 的代謝可能存在個體與種族間差異。從體外代謝產物的提取離子色譜圖峰面積得知，AB-CHMINACA 以甲酰胺水解代謝產物、甲基丙基側鏈羥化代謝產物、N-脫烷基代謝產物和酰胺水解代謝產物為主。綜上，推薦AB-CHMINACA 的甲酰胺水解代謝產物（2-（1-（環己基甲基）-1H-吲唑-3-甲酰胺）-3-甲基丁酸）和甲基丙基側鏈羥化代謝產物（2-（1-（環己基甲基）-1H-吲唑-3-甲酰胺）-4-羥基-3-甲基丁酸）可作為AB-CHMINACA 濫用常規尿液樣本分析的生物標志物。

表3 人體體外AB-CHMINACA 代謝產物和濫用者尿液樣本中代謝產物的對比

本研究建立了在肝微粒體體外代謝模型基質中與體內尿液樣本中合成大麻素類新精神活性物質AB-CHMINACA 代謝產物的LC-HRMS 分析檢測方法。 該方法簡便快捷，為臨床和法庭科學案例中濫用此新精神活性物質的檢測提供了理論依據和技術支持。