基于數據挖掘與網絡藥理學技術的中藥治療非增殖期糖尿病視網膜病變經驗總結

吳小翠 楊智華 謝毅強 李 瑞 程亞偉

1.海南省中醫(yī)院內分泌科，海南海口 570203；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州 510006；3.海南醫(yī)學院中醫(yī)學院，海南海口 571199；4.海南省中醫(yī)院眼科，海南海口 570203；5.海南省中醫(yī)院治未病中心，海南海口 570203

糖尿病及其并發(fā)癥是全球第九大死亡原因，糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）就是其中最常見的一種[1]。DR 的發(fā)生被認為與低度炎癥[2]、氧化應激[3]等多種分子途徑機制有關，其發(fā)生與發(fā)展與糖尿病血糖控制息息相關[1]。非增殖期DR（non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）是DR 的早期階段，其特征為視網膜出血、視網膜內微血管異常、微動脈瘤和棉絮斑等[4]，西醫(yī)治療常在控制血糖的基礎上給予營養(yǎng)神經、抑制血管生成、促進微循環(huán)的藥物，并配合激光治療[5-7]。但常規(guī)的治療手段如糖皮質激素往往會引起眼內壓增高、惡心、嘔吐等不良反應，而中醫(yī)藥治療NPDR 則著眼于辨證施治、調理臟腑[8-9]，治療疾病的同時個性化地改善患者的不良反應，已逐漸成為NPDR治療中不可或缺的一環(huán)。本研究采用數據挖掘結合網絡藥理學、分子對接技術對中醫(yī)藥治療NPDR 的中藥方劑進行系統(tǒng)分析，挖掘相關的分子機制，為后續(xù)的機制研究打下基礎。

1 資料與方法

1.1 中藥治療NPDR 處方數據挖掘

1.1.1 文獻來源 檢索中國知網、萬方數據庫中有關中醫(yī)藥治療NPDR 的相關文獻，檢索期限為數據庫建庫至2020 年12 月。

1.1.2 納入標準①主題含“糖尿病視網膜病變”“糖網”或“消渴目盲”“消渴”；“中醫(yī)藥”“中草藥”或“中醫(yī)”或“中藥”。②使用口服單純中藥或以口服中藥為主結合其他方法治療NPDR 的臨床研究。

1.1.3 排除標準①處方組成有缺失；②綜述、單純動物實驗的文獻；③個人經驗、個案報道。

1.1.4 中藥規(guī)范化處理 參考《中藥學》[10]、《中華人民共和國藥典》[11]，對納入文獻中的藥物名稱及性味、歸經進行規(guī)范化處理。如“法半夏”“姜半夏”“制半夏”統(tǒng)一為“半夏”，“玄胡”“元胡”統(tǒng)一為“延胡索”等。

1.1.5 方劑錄入與核對 依照上述規(guī)范化處理原則，將整理好的處方一一錄入計算平臺的“方劑管理”模塊，一位研究人員錄入，另一位研究人員進行二次審核校對，以確保數據資料準確無誤。

1.1.6 數據分析 采用中醫(yī)傳承計算平臺V3.0 的“藥物統(tǒng)計”對藥物的使用、性味、歸經的頻率、頻次及分布進行統(tǒng)計分析；運用“數據分析系統(tǒng)”進行組方規(guī)律分析及聚類分析，設置支持度為15%，置信度為0.5。

1.2 高頻藥對網絡藥理學分析

1.2.1 高頻藥對有關化學成分和基因的獲取 將數據挖掘所得到使用頻次最高的藥對組合輸入中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學數據庫分析平臺、中醫(yī)藥綜合數據庫，并按照口服利用度≥30%，成藥相似性≥0.18 的篩選條件，在兩個數據庫中獲取該藥對組合的主要化學成分以及可能作用的靶點。將所得的靶點名稱輸入Uniprot數據庫以查找有關靶點對應的基因名以及編號。最后，將靶基因和中藥主要化學成分作映射，構建“成分-靶點”圖。

1.2.2 糖尿病視網膜病變的潛在靶點收集 在GeneCards數據庫以“non-proliferative diabetic retinopathy”“diabetic retinopathy”為主要檢索詞搜索與糖尿病視網膜病變有關的疾病作用靶點，選擇Score 值≥10 的疾病靶點與高頻藥對中的相關基因進行交叉，得到高頻藥對治療糖尿病視網膜病變的作用基因。

1.2.3 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建 將高頻藥對治療糖尿病視網膜病變的作用基因輸入STRING 數據庫（https://string-db.org/），選擇“Homo sapiens”類別后，設置置信度為0.4。將所獲得的分析結果以tsv 文件形式導入Cytoscape 3.7.2 中，根據Cytoscape 軟件的程序包進行計算，篩選出節(jié)點度值較大的靶點作為PPI 核心網絡。

1.2.4 KEGG 和GO 富集分析 將高頻藥對治療糖尿病視網膜病變的作用基因輸入R 軟件（R 4.0.2），調用clusterProfiler 包，對這些基因從細胞組分、分子功能、生物過程3 個方面進行注釋。GO 分析是對基因本身功能的注釋，而KEGG 分析則是對于基因參與人體活動的相關通路注釋。利用R 語言程序中的cluster-Profiler 程序包對關鍵靶點基因進行GO 富集分析。GO 結果均以條形圖格式輸出。將關鍵靶點基因用R語言程序中的pathview 程序包進行KEGG 富集通路分析，以基因比率為橫軸、通路名稱為縱軸、氣泡顏色代表P 值，繪制氣泡圖。

1.2.5 分子對接技術 在RSCB-PDB 數據庫（http://www.rcsb.org/）查找篩選出的排名最高的晶體結構，利用ZINC 數據庫（http://zinc.docking.org/）查找篩選出的口服利用度及成藥相似度最高的化學成分的Mol2 結構式，將活性成分與靶標一并導入AutoDock 軟件，對活性成分和靶標進行虛擬分子對接分析。一般認為，結合能＜0 的分子即可自行結合，而數值越小結合力越強，既往同行研究提示，結合能≤-5 kJ/mol 可視為該化學成分可與作用靶標有效結合[12]。

2 結果

2.1 中藥頻次

通過文獻篩選獲得107 首處方，共涉及151 味中藥，累計頻次達936 次。其中頻次≥10 次的有27 味，見表1。

2.2 中藥功效、歸經及四氣五味

151 味中藥共涵蓋10 種功效，其中使用頻次較高的包括補虛類、清熱類、活血化瘀類。四氣以寒、平、溫性為主；五味主要以苦、甘味為主；歸經主要歸為肝、肺、腎經。見圖1。

圖1 中藥功效、歸經、四氣、五味統(tǒng)計圖

2.3 高頻中藥關聯(lián)規(guī)則分析

藥物核心組合的頻次及關聯(lián)程度見表2～3、圖2，其中中藥組合黃芪-生地出現頻次最高。

圖2 藥物關系網絡

表2 藥物核心組合頻次（前10 位）

表3 藥物核心組合關聯(lián)程度（前10 位）

2.4 高頻藥對黃芪-生地治療NPDR 的網絡藥理學分析

2.4.1 藥物成分及靶點篩選、NPDR 關鍵靶點篩選及網絡分析 得到黃芪、生地的活性成分共26 個，以及對應的靶點1 280 個。剔除重復項和無對應活性成分的靶點后，得到黃芪、生地的活性成分靶點共497 個。將NPDR 相關的疾病靶點與黃芪、生地的活性成分靶點匹配映射，得到共同靶點47 個，即黃芪-生地藥對治療NPDR 的關鍵靶點。將中藥活性成分、關鍵靶點導入Cytoscape 軟件，構建中藥活性成分-關鍵靶點網絡，見圖3。網絡中有61 個節(jié)點（包括14 個活性成分及47 個關鍵靶點）。在該網絡中，藥物活性成分與關鍵靶點之間的連線代表該活性成分可能與這個關鍵靶點有聯(lián)系，連線越多提示該成分在治療NPDR 的過程中發(fā)揮的作用越大。連線較多的藥物活性成分有槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素、異鼠李素、7-O-methylisomucronulatol 等。

圖3 活性成分-關鍵靶點網絡圖

2.4.2 關鍵靶點PPI 網絡分析 關鍵靶點的PPI 網絡圖見圖4。PPI 核心網絡圖中，節(jié)點度值越大提示該蛋白在PPI 網絡中的位置越重要，得到黃芪-生地藥對治療NPDR 的核心靶點有SPP1、TP53、SERPINE1、PTGS2、FOS、CCND1、VEGFA、TNF 等，見圖5。

圖4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

圖5 蛋白質-蛋白質相互作用核心網絡圖

2.4.3 GO 與KEGG 富集分析 關鍵靶點GO 富集分析結果顯示，這些關鍵靶點基因涉及1 942 條通路，靶點基因數目前30 條繪制成柱狀圖見圖6，關鍵靶點KEGG 通路分析見圖7，可見黃芪-生地藥對治療NPDR 的主要通路包括有細胞對化學應激的反應、生殖結構發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、上皮細胞增殖、細胞對脂多糖反應等。

圖6 GO 富集通路柱狀圖

圖7 KEGG 富集通路氣泡圖

2.4.4 分子對接分析 根據“藥物-活性成分-疾病-靶點”網絡中交集靶點的運算結果，篩選出黃芪-生地藥對中的核心活性成分有兩個，分別是槲皮素、山柰酚，其成分化學結構見圖8。以網絡連線數（分值）為主要依據，篩選得到4 個核心靶點蛋白VEGFA、CASP3、ICAM1、SERPINE1，其關聯(lián)性均0.595 588 235，網絡分值及網絡連線數均為19，特征向量均為0.228 793 263。對核心活性成分與核心靶點蛋白進行分子對接。核心靶點蛋白和核心活性成分對接的自由能計算結果顯示，槲皮素與VEGFA、ICAM1、SERPINE1的結合能分別為-8.1、-6.7、-6.7 kJ/mol，山柰酚與CASP3 的結合能為-7.3 kJ/mol，提示其與NPDR 中的關鍵核心靶點有良好的結合作用。見圖9～10。

圖8 黃芪-生地藥對核心活性成分化學結構

圖9 槲皮素與 與VEGFA、ICAM1、SERPINE1 的對接示意圖

3 討論

NPDR 是由于血糖控制不佳引起的糖尿病常見微血管并發(fā)癥之一，屬于中醫(yī)范疇中的“消渴目病”范疇，多因為臟腑功能失調，氣血痹阻、陰陽平衡失調導致消渴病，而消渴病日久遷延至雙目所致，中醫(yī)藥對本病的治療效果確切[13]。為更好地總結近年來各家用中醫(yī)藥治療NPDR 的學術思想與用藥經驗，本研究同時采用數據挖掘與網絡藥理學分析方法，探討中藥治療NPDR 的一般規(guī)律和關鍵藥物的作用機制，可以為中醫(yī)藥治療NPDR 提供一個重要的參考依據。

圖10 山柰酚與CASP3 對接示意圖

對處方進行功效、歸經分析，分析結果提示最常用的中藥為補虛藥，其次為清熱藥與活血化瘀藥，主要歸肝、脾、腎經。對納入的151 味中藥進行關聯(lián)分析得到治療NPDR 的核心中藥，其中包括黃芪、生地、葛根、三七等。其中黃芪益氣固表，養(yǎng)血生肌；生地黃清熱生津、涼血止血；葛根清熱解毒，生肌止渴；三七活血化瘀。其中黃芪常與生地配伍共同發(fā)揮益氣養(yǎng)陰，清熱生津，涼血止血的功效。中醫(yī)認為NPDR 的發(fā)病病機為氣陰兩虛、陰虛火旺或氣血瘀滯，提示治療應當以益氣養(yǎng)陰、補益肝腎、清熱涼血、化瘀通絡為主[14]，配以益氣健脾[15]。四氣五味統(tǒng)計結果提示治療NPDR的中藥多以寒、溫、平及甘、苦為主，甘味平性藥多為益氣健脾補虛中藥，性寒味苦的中藥多具有疏風清熱涼血功效，辛溫的中藥多能疏肝健脾，因此在臨床上較為常用。目前中醫(yī)各家比較一致地認為，消渴目病是由于先天稟賦不足或后天失養(yǎng)，導致肝腎陰虛，陰虛生火，虛火灼精，血液黏稠成瘀，精、氣、血不能上養(yǎng)于目所致[16]。因此NPDR 的中醫(yī)治療以標本兼治為原則，治本以益氣養(yǎng)陰為主，治標則當活血化瘀。

治療NPDR 的核心中藥藥對黃芪-生地中的活性成分包括槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素、異鼠李素、7-O-methylisomucronulatol 等。槲皮素能有效減輕高糖條件下人腎小球內皮細胞損傷，從而抑制糖尿病進展，這一作用與激活PI3K/Akt 通路調節(jié)細胞活力、細胞凋亡、凋亡基因mRNA 表達量有關[17-18]；亦可通過調控細胞自噬抑制高糖誘導的脈絡膜和視網膜血管生成[19]，對延緩、減輕DR 具有一定作用。山柰酚對高糖條件下人腎小球內皮細胞氧化應激及凋亡具有抑制作用，可控制糖尿病腎損傷[20]。徐曉紅等[21]的研究發(fā)現，山柰酚通過靶向VEGF 和PGF 基因抑制微血管發(fā)生，抑制Src-Akt1-Erk1/2 信號通路的激活，可能是治療DR 的潛在藥物。刺芒柄花素屬于黃芪總黃酮的一種，通過抑制缺氧ARPE-19 細胞分泌血管內皮生長因子，防止體內缺氧誘導的視網膜血管新生[22]。異鼠李素能有效抑制氧化應激損傷[23]，這可能對高糖狀態(tài)下的視網膜損害具有保護作用。PPI 網絡中黃芪-生地治療NPDR 的核心靶點包括SPP1、TP53、SERPINE1、PTGS2、FOS、MAPK1、VEGFA、TNF 等。其中TNF 基因編碼一種多功能促炎性細胞因子，屬于腫瘤壞死因子超家族，這種細胞因子主要由巨噬細胞分泌，參與調節(jié)胰島素抵抗，在糖尿病發(fā)展中起到不可忽視的作用[24]。SERPINE1 基因編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，絲氨酸蛋白酶抑制劑具有增加胰島素敏感性、調節(jié)脂類代謝及調節(jié)血糖代謝等功能[25]，可通過調控TNF、SERPINE1 表達量，減輕胰島素抵抗，繼而延緩糖尿病進展及并發(fā)癥的發(fā)生。VEGFA 基因編碼一種肝素結合蛋白，以二硫鍵連接的同二聚體存在，這種生長因子誘導血管內皮細胞增殖和遷移，參與視網膜病理血管生成[26]，對改善視網膜血管病變可能有直接作用。TP53 調節(jié)細胞代謝（包括細胞自噬及細胞成分的分解和重塑），通過這些代謝活動維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定和支持細胞生長[27]，其信號通路影響線粒體功能和視網膜色素上皮細胞增殖[28]。黃芪-生地藥對的核心有效成分與核心靶點蛋白進行模擬對接的結合能＜-5 kJ/mol，提示有效成分和靶點蛋白之間的結合較為緊密，黃芪-生地藥對對NPDR 有潛在治療效果，結合網絡藥理學分析結果，后續(xù)可進一步研究山柰酚、槲皮素、異鼠李素、刺芒柄花素等干預NPDR 的作用與機制，過表達或敲除相關核心靶點研究其上下游關系，探索中藥治療NDPR 新機制。

黃芪-生地參與治療NPDR 的主要通路可能包括細胞對化學應激的反應、生殖結構發(fā)育、細胞對脂多糖反應、上皮細胞增殖等。氧化應激損傷胰島β 細胞和降低外周組織對胰島素的敏感性，導致糖尿病的發(fā)生發(fā)展[3]；生物活性氧包括O2、OH-、H2O2、NO 等，是線粒體氧化代謝的產物，為氧化應激的主要標志物。活性氧在糖尿病及并發(fā)癥機制中的作用主要是對組織和細胞的毒性損傷，還是重要的細胞內信使，能夠活化許多信號傳導通路，間接損傷組織和細胞[29-30]。上皮細胞增殖同樣屬于糖尿病視網膜病損的重要因素，在高糖狀態(tài)下，包括視網膜色素上皮細胞在內的細胞更新（凋亡、增殖、肥大）模式會隨著線粒體活性氧和氧化應激的增加，最終導致視網膜血管生成和組織重塑[3]。

綜上所述，中醫(yī)藥治療NPDR 以益氣養(yǎng)陰、補益肝腎、清熱涼血、化瘀通絡為常規(guī)治則，用藥以補虛最為多見，次而配伍清熱涼血。文獻處方中的核心組合黃芪-生地，可能主要通過槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素等活性成分，作用于SPP1、TP53、SERPINE1、PTGS2、FOS、CCND1、VEGFA、TNF 等相關疾病靶點，調控對化學應激的反應、生殖結構發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、上皮細胞增殖等相關細胞信號通路，共同發(fā)揮NPDR 的治療作用，體現了中醫(yī)藥治療針對多靶點、多通路的特點。但是本研究僅在理論上研究中醫(yī)藥治療NPDR 的一般規(guī)律和相關機制，后續(xù)仍需要更多臨床實踐和進行相關實驗予以驗證。