小劑量5-脫氧雜氮胞苷誘導HepG2 肝癌細胞新生腫瘤-睪丸抗原CT10 和SSX1 表達及其意義

張 鶴 趙慧霞 曾志艷 李慶艷 云 超 關 娜 李秋文 肖文華

解放軍總醫院第四醫學中心腫瘤內科，北京 100048

肝細胞肝癌是我國常見惡性腫瘤，嚴重威脅人們的健康和生命。當前抗血管生成聯合免疫檢查點抑制劑（immune-check point inhibitor，ICI）的治療使晚期肝癌患者的平均生存時間超過1 年[1]，但仍有提升的空間。ICI 的治療目的主要是釋放細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T cell，CTL）的殺瘤能力；產生CTL 必須具有的特異性腫瘤抗原，尤其是腫瘤新抗原（tumour neoantigen，TNA）[2]。當前TNA 定義是腫瘤基因編碼區非同義突變產生的新的癌蛋白[2]；然而，該定義并不全面，忽略了另一大類受表觀遺傳調控的、與TNA 同樣具有腫瘤特異性和強大免疫原性的新抗原腫瘤-睪丸抗原（cancer-testis antigen，CTA）。CTAs 是一大類只在睪丸和腫瘤中表達的免疫原性較強的腫瘤相對特異抗原，因高甲基化而沉默。由于腫瘤的廣泛低甲基化，導致位于X 染色體的CTAs 基因不同程度去甲基化，部分沉默的CTAs 重新開放表達并誘導免疫反應[3]。但是，由于CTAs 表達水平受其去甲基化程度的影響，同一腫瘤不同個體，甚至同一腫瘤不同亞克隆瘤細胞的CTAs 表達存在明顯的異質性。長期的低濃度CTAs 慢性刺激將導致CTL 失能或衰竭，或CTAs 被再甲基化而再次沉默從而影響免疫治療效果或產生繼發性耐藥[3-4]。因此，新生CTAs（novel cancer-testis antigens，nCTAs）的產生是提高免疫治療或逆轉免疫耐藥的重要措施之一。5-脫氧雜氮胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine，5-aza-CdR）是DNA 甲基轉移酶抑制劑，能使CTAs去甲基化并重新和持續表達[5]，但由于該藥存在細胞毒性，限制了臨床廣泛應用。本文目的是探討小劑量的5-aza-CdR 能否誘導肝癌細胞表達nCTAs，為未來制訂肝癌的免疫治療及免疫耐藥的再挑戰提供對策。

1 材料與方法

1.1 肝癌細胞株和主要試劑

肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721 和BEL-7402 購自中國細胞收藏中心，MHCC97L 和MHCC97M3 購自復旦大學中山醫院肝癌研究所；胎牛血清（北京中科康源生物科技公司，貨號：#13011-611）；兔抗人CT10抗體（英國Abcam 公司，貨號ab209667）；鼠抗人-tubulin 抗體和羊抗兔二抗（美國Sigma 公司，貨號分別為#T9026 和#12-349）；5-aza-CdR（美國Sigma 公司，貨號：#2353-33-5）；Trizol RNA 提取試劑盒（美國Qiagen 公司，貨號：#97306）；Oligo（dT）、RT-PCR 試劑盒、Moloney 小鼠白血病病毒反轉錄酶（美國Promega 公司，貨號分別為：#M1701 和#A1260）；DNA Marker、Taq 酶（德國Qiagen 公司，貨號分別為#929560和#201203）；蛋白濃度Bio-Rad 測定試劑盒（美國Bio-Rad 公司，貨號：#5000002EDU）。

1.2 細胞培養

人肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721、BEL-7402，MHCC97L 和MHCC97M3 在含10%胎牛血清和各100 U/ml 的青、鏈霉素的高糖DMEM 培養基中，于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養、胰酶消化傳代，取對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.3 藥物處理

將處于對數生長期的肝癌細胞株HepG2 按每組接種1×104個細胞于培養瓶中繼續培養，每組重復3 次，24 h 后換新鮮配制的分別含5-aza-CdR 0、0.5、1.0、1.5 μmol/L 的培養液于四組培養瓶中培養3 d，每24 h 更換培養液，0 mmol/L 處理的細胞作為對照組，0.5 μmol/L 為實驗1 組，1.0 μmol/L 為實驗2 組，1.5 μmol/L為實驗3 組。5-aza-CdR 藥物濃度的選擇是參照以前的實驗研究和文獻[5]而選定的。

1.4 RT-PCR 技術檢測CTAs mRNA 表達

用Trizol 試劑（Gibco BRL）提取總RNA；參照試劑盒說明書用oligo-dT 引物和Moloney 小鼠白血病病毒逆轉錄酶逆轉錄為cDNA，RT 反應體系包括總RNA 2 μg，oligo-dT 0.5 μg，10×緩沖液2 μl，dNTP 1 mmol/L，RNasin 20 U，Moloney 小鼠白血病病毒逆轉錄酶200 U，去離子水，總反應體積20 μl；然后采用PCR 擴增cDNA，所用PCR 擴增儀為Smart Cycler（Biotech，Beijing）；PCR 反應體系總體積30 μl，其中含去離子水22.5 μl，10×緩沖液3 μl，上下引物各1 μl（500 pmol/L），dNTP 1 μl（200 μmol/L），Taq 酶0.5 μl（1 U），相應cDNA 1 μl；擴增參數為：先95℃變性5 min，然后95℃20 s，退火45 s（退火溫度見表1），72℃延伸30 s，共循環36 次，最后72℃孵育10 min；將PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離，EB 染色、照相。所用引物見表1。

表1 PCR 擴增各種CTAs 引物序列

1.5 Western blot 檢測HepG2 細胞CT10 蛋白表達

由于SSX 抗原有9 個成員，其氨基酸序列同源性高達87%～96%，到目前為止尚無針對任一SSX 成員的特異性抗體，不能進行單個SSX 的蛋白印跡。收集培養處于對數生長期的HepG2 肝癌細胞于含蛋白酶抑制劑的緩沖液中裂解，蛋白濃度采用Bio-Rad 測定試劑盒測定。取50 μg 蛋白于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離過夜，并將凝膠中分離的蛋白轉印至聚偏氟乙烯復合分離膜（美國Bio-Rad，貨號：1620177），在4℃下，用5%去脂乳液封閉非特異成分，用封閉液稀釋一抗CT10，稀釋度為1∶100，在Tris-緩沖液中與抗CT10 抗體進行雜交過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（稀釋度為1∶2 500）室溫孵育1 h，洗膜、ECL 法發光、X 線曝光、照相。采用SSX1 和CT10 表達量與內參照β-actin 表達量的灰度比值作為兩種CTAs 的相對表達量。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。并采用SNK-q 法進行均數多重比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌細胞株CTAs 的差異表達

在SMMC-7721、BEL-7402、MHCC97L、MHCC97M3和HepG2 肝癌細胞株中，MAGE1、MAGE3、CT10、CTp11、NY-ESO-1 和SSX1 存在差異表達，其中HepG2 表達MAGE1、MAGE3、CTp11 和NY-NSO-1，MHCC97L 和MHCC97M3表達MAGE1、MAGE3、CT10、CTp11和SSX1，BEL-7402 表達MAGE1、MAGE3 和CTp11，而SMMC-7721 只表達MAGE1、MAGE3，見圖1。在HepG2 肝癌細胞株中，MAGE1、MAGE3、CTp11 和NY-ESO-1 表達，但CT10 和SSX1 不表達；選擇HepG2 肝癌細胞株作為下一步研究的細胞模型。

圖1 5 株肝癌細胞CTAs 的差異表達（n＝3）

2.2 5-aza-CdR 可誘導新的CT10 和SSX1 的表達

2.2.1 小劑量5-aza-CdR 誘導新抗原CT10 和SSX1 mRNA 表達RT-PCR 檢測發現對照組無新生CTA SSX1 和CT10 表達，實驗1、2 和3 組均可誘導HepG2 細胞SSX1 和CT10 新生抗原不同程度表達。在SSX1 表達上，實驗3 組mRNA 表達高于實驗1、2 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；實驗2 組表達高于實驗1 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。在CT10 表達上，實驗3 組表達高于實驗1 組和2 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；實驗1 組和2 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 不同濃度5-aza-CdR 誘導HepG2 肝癌細胞株新生SSX1和CT10 mRNA 表達（n＝3）

2.2.2 小劑量5-aza-CdR 誘導新抗原CT10 蛋白的表達Western blot 顯示對照組無CT10 蛋白表達，實驗1、2 和3 組均可誘導CT10 蛋白表達，實驗3 組相對表達量最高，與實驗1 組和2 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；實驗1 組和2 組相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 不同濃度5-aza-CdR 誘導HepG2 肝癌細胞株新生CT10 蛋白表達水平比較（n＝3）

3 討論

狹義的NTA 一般被認為是腫瘤癌基因編碼區發生導致氨基酸發生改變的非同義突變，這些癌蛋白具有較強的免疫原性，容易被機體識別為外來抗原并產生特異的CTL，NTA 是ICI 治療效果的另一重要的指標[6]。總之，NTA 需具備兩個基本條件：①機體免疫系統從未接觸過只在癌細胞中表達的癌蛋白，即抗原表達的腫瘤特異性；②癌蛋白具有較強的免疫原性，即該抗原能刺激機體產生CTL 細胞。那么CTAs 蛋白是機體成熟免疫系統從來未接觸的腫瘤相對特異、只在腫瘤和睪丸生殖細胞中表達，后者由于缺乏MHC Ⅰ分子，不能激發起相關免疫反應，即CTAs 的腫瘤特異性；同時，CTAs 具有較強的免疫原性，能誘導機體產生強大的免疫反應，在既往腫瘤疫苗、CTL 和CAR-T制備及聯合免疫治療中都顯示出強大的抗腫瘤作用[7]，符合腫瘤新生抗原的兩大基本特點。因此，認為CTAs 盡管沒有發生基因突變和蛋白質氨基酸改變，而是通過表觀遺傳修飾的變化產生的新抗原，本研究首次提出nCTAs 是廣義的腫瘤新生抗原。ICI 阻斷PD-1/PD-L1 免疫負性調節，解除其對已經存在腫瘤微環境中的CTL 的禁錮，釋放其殺傷腫瘤細胞的能力，是目前逆轉免疫耐藥的重要手段[8]，但對嚴重T 細胞功能衰竭和CTL 數量衰減的免疫功能恢復較困難[9]，亟須更多新生的腫瘤抗原豐富T 細胞受體多樣性，刺激產生更多的、新的CTL 克隆來對付抗原已經變異的腫瘤細胞，是恢復抗腫瘤免疫反應的關鍵因素之一。

除了因腫瘤基因突變產生的新抗原外，以5-aza-CdR 為代表的表觀遺傳藥物可以催生腫瘤細胞新生CTAs 表達，即新出現的具有強免疫原性nCTAs，可以誘導產生新的CTL 克隆。5-aza-CdR 為DNA 甲基轉移酶抑制劑，除抑制其酶活性外，還可降低其轉錄水平[10]，使CTAs 基因5’端啟動子CpG 島去甲基化而促進基因的表達[7,11]。除此之外，體外較大劑量5-aza-CdR可誘導DNA 的快速損傷和嚴重的細胞毒性，甚至使正常細胞發生基因表達異常[12]；因此，目前的5-aza-CdR 表觀遺傳治療腫瘤目的是把因高甲基化失活的抑癌基因或CTAs 甲基化水平降低到能再次表達，盡量減少5-aza-CdR 劑量而去除因較高劑量所致的細胞毒性，即非細胞毒性的表觀遺傳治療[13-14]。Karahoca 等[15]總結了5-aza-CdR 在體內外使用的劑量和時間，發現不同腫瘤類型來源的細胞株對5-aza-CdR的敏感性不一樣，其敏感性除了與藥物濃度有關外，還與藥物作用時間長短相關；即使同為結腸癌來源的細胞株之間對5-aza-CdR 的敏感性也不一樣[15]。Tsai等[13]發現100 nM 5-aza-CdR 短暫處理癌細胞，就可以使乳腺癌細胞株、肺癌細胞株和結腸癌細胞株基因組廣泛低甲基化，受高甲基化失活的抑癌相關基因去甲基化并重新表達、癌細胞生長受阻、凋亡增加，相關重要的細胞生長信號通路受到抑制；在肝癌細胞株的研究中，絕大多數5-aza-CdR 的濃度均在1～100 μmol/L之間[16-18]。在前期基礎研究中，還發現小劑量5-aza-CdR 只誘導腫瘤細胞CTAs 表達，而不誘導正常上皮細胞CTAs 的表達，其機制可能與癌變的細胞CTAs本身存在不同程度的低甲基化狀態，小劑量的5-aza-CdR 就可使CTAs 能表達的去甲基化程度[19]；在一項5-aza-CdR 治療肝轉移性腫瘤的Ⅰ期臨床研究中發現：肝動脈灌注5-aza-CdR 可使30 個CTAs 中的21 個表達上調[20]；此外，5-aza-CdR 已經批準用于骨髓異常增生綜合征的適應證，臨床發現常規劑量5-aza-CdR常常導致嚴重的骨髓抑制。因此，探索小劑量和超小劑量5-aza-CdR 有實際臨床意義[21-22]。本研究采用了5 株肝癌細胞株，采用RT-PCR 技術分析了MAGE1、MAGE3、CTp11、CT10、NY-ESO-1 和SSX1 等6 種CTAs抗原的mRNA 表達，發現5 株肝癌細胞表達不同的CTAs，呈現明顯的異質性，提示針對CTAs 的特異免疫治療需先確定腫瘤CTAs 的表達譜，然后篩選出不表達CT10 和SSX1 的肝癌細胞株HepG2 作為本實驗的細胞模型，并分別采用3 種低劑量的5-aza-CdR處理HepG2 細胞，結果發現0.5 μmol/L 低濃度的5-aza-CdR 就可以誘導本身不表達CT10 和SSX1 的HepG2 肝癌細胞表達，并且呈劑量依賴性，提示CT10和SSX1 為HepG2 肝癌細胞株的新生抗原；同時小劑量的5-aza-CdR 也減少了藥物的細胞毒性，增加了藥物的依從性和聯合其他藥物的機會；理論上推測這種具有較強的免疫原性的nCTAs 更能刺激機體免疫系統產生新的CTL 克??；在聯合ICI、過繼免疫和其他改善免疫微環境的治療情況下，大幅度提高免疫治療效果，對免疫耐藥的復發和難治性腫瘤的解救治療也發揮了重要的作用[23-25]。本研究在當前惡性腫瘤免疫治療時代，率先提出了小劑量的5-aza-CdR 通過表觀遺傳機制誘導nCTAs，豐富了TNA 的理論，為表觀遺傳藥物聯合ICI 免疫治療惡性腫瘤提供了實驗依據。