基于生信分析篩選乙型肝炎相關肝細胞癌關鍵基因及其中藥防治預測與系統評價

吳輝淵

江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330006

我國年新發肝癌38.9 萬例，約為全部新發癌癥的9.6%［1］。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)約占原發性肝癌90%，我國的HCC 主要由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染引起（約占80%）［2］。中藥治療乙型肝炎相關肝細胞癌具有獨特的療效和優勢［3-13］，本研究通過生物信息學研究方法，篩選出乙型肝炎相關肝細胞癌的關鍵基因并預測相關治療中藥，運用系統評價方法進一步驗證其療效。

1 資料和方法

1.1 獲取基因芯片數據

從GEO 數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載基因芯片數據集（GSE121248，GSE47197），其中GSE121248 芯片數據采用GPL570 平臺，包括HBV 相關HCC 患者的70 個腫瘤組織，37 個臨近非腫瘤組織；GSE47197 芯片數據采用GPL16699平臺，包含HBV 相關HCC 患者的61 個腫瘤組織，63 個臨近非腫瘤組織。類型設置為expression profiling by array，種屬為“homosapiens”。

1.2 數據的處理與篩選

應用GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）在線工具及EXCEL 軟件，以adj.P＜0.05、|logFC|＞1為標準篩選2 個芯片HCC 患者腫瘤組織與鄰近非腫瘤組織的差異基因（DEGs），應用 Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）得到交集DEGs，并繪制韋恩圖。

1.3 差異基因的功能注釋

通過Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）在線工具對1.2 獲得的交集DEGs 進行基因本體（GO）功能、京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，背景基因設置為“homosapiens”，篩選條件設為P＜0.05。

1.4 蛋白互作網絡分析與關鍵基因的篩選

將1.2 獲得的交集DEGs 導入到STRING（https://cn.string-db.org/）進行蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析，設置物種為“homosapiens”，highest confidence ≥0.4。將數據導入Cytoscape 3.8.2 軟件進行可視化，用CytoHubba 插件對網絡進行關聯度分析，并根據degree 進行排序，排名前10 的DEGs 作為關鍵基因。

1.5 關鍵基因的分析

利 用UCSC Xena（https://xena.ucsc.edu/）分 析關鍵基因在原發性肝癌和正常組織的表達差異；根據每個關鍵基因的表達水平的高低，采用Kaplan-Meier Plotter（http://www.kmplot.com/analysis/）數 據庫作生存曲線，采用Logrank 檢驗。

1.6 關鍵基因的中藥預測

將乙型肝炎相關肝細胞癌患者關鍵基因輸入Coremine Medical (https://coremine.com/)檢索框，以P＜0.05 且被《中國藥典》2020 年版收錄為標準進行潛在治療中藥的篩選。最后預測得出與HBV 相關HCC 關系較為密切的中藥。

1.7 預測中藥的評價與驗證

對預測中藥的有效性采用Meta 分析進行驗證，以“肝癌”“中藥”“療效”等為檢索詞，檢索中國知網（CNKI）、維普（VIP）、萬方等中文數據庫，從各數據庫建庫到2022 年4 月20 日。納入標準：（1）研究對象：病理或臨床確診的HCC 患者；（2）干預方式：對照組采用單純TACE，觀察組采用中藥+TACE，中藥處方包含3 種及以上預測中藥。收集每項研究中第一作者姓名、發表時間、研究患者平均年齡、各組病例數等數據。觀察兩組治療后的實體瘤客觀緩解率（完全緩解+部分緩解）。采用STATA 17 軟件做Meta 分析。對結果進行異質性檢驗，若P＞0.10 且I2≤50%則認為異質性小，采用固定效應模型進行分析。如納入研究的文獻數≥10，采用“漏斗圖”檢查文獻是否存在發表偏倚。

2 結果

2.1 差異基因數據的獲取

GSE121248 芯片中共包含1 320 個DEGs，其中下調基因897 個，上調基因423 個；GSE47197 芯片含有DEGs1 178 個，其中下調基因953 個,上調基因255 個。繪制了2 個芯片DEGs 的火山圖（圖1、圖2）。應用Venny 軟件作圖（圖3）,得出2 個芯片的交集DEGs 403 個，包括上調基因82 個；下調基因321 個。

圖1 GSE121248 DEGs 火山圖

圖2 GSE47197 DEGs火山圖

圖3 交集DEGs Venn圖

2.2 差異基因的功能注釋

通過Metascape 在線數據庫對403 個交集DEGs 進行功能注釋。GO 富集分析包括三方面：分子功能（MF），生物過程（BP），細胞組分（CC），其中MF 主要與氧化還原酶活性、CH-OH 供體組等功能有關；BP 主要與一元羧酸代謝、小分子分解代謝、烯屬化合物代謝過程等功能有關；CC 主要與細胞外基質、血液微粒、膜攻擊復合物有關。KEGG 分析表明：視黃醇代謝、補體和凝血級聯反應、色氨酸代謝、PPAR 信號通路、p53 信號通路等為主要通路。

2.3 蛋白互作網絡分析與關鍵基因的篩選

將2.1 得 到 的403 個 交 集DEGs 導 入String在線數據庫，得到蛋白互作網絡，再將其數據傳入Cytoscape 3.8.1 軟件進行可視化展示。利用CytoHubba 插件根據degree 進行排名，選取排名前10 的基因作為關鍵基因，具體包括CDK1，CCNB1，AURKA，CCNB2，CDKN3，BIRC5，ESR1，NDC80，TPX2，ASPM。見圖4。

圖4 DEGs的PPI網絡圖

2.4 關鍵基因在肝癌組織與正常組織的表達差異

利用UCSC Xena 分析核心基因在原發性肝癌和正常組織的表達差異，除ESR1 在肝癌組織表達下降之外，其他9 個關鍵基因均在肝癌組織表達上調，經檢驗結果均為P＜0.001，提示差異有統計學意義。

2.5 關鍵基因生存分析

利用Kaplan-Meier Plotter 數據庫分析上述10個關鍵基因生存曲線，經Logrank 檢驗，P＜0.01，均差異有統計學意義。

2.6 作用于關鍵基因的中藥預測

將2.3 篩選得出的 10 個關鍵基因輸入到Coremine Medical，共得出與HBV 相關HCC 有潛在治療作用的43 種中藥，具體見表1。

表1 中藥預測

2.7 系統評價

按納入標準，共檢索到文獻11 篇，見表2，經異質性檢驗（P=0.99，I2=0.00%），采用固定效應模型，結果顯示［OR=0.55，95%CI：（0.28，0.81）］，合并效應檢驗Z=4.00，P＜0.001，說明觀察組顯著優于對照組，見圖5。運用STATA17 軟件進行偏倚性檢測，結果11 個納入的研究分布在中心線兩側，大多位于漏斗圖偏上，均在95%置信區間內，散點分布基本對稱，發表偏倚不明顯，見圖6。

表2 納入研究的基本特征

圖5 臨床總有效率Meta分析圖

圖6 偏倚分析圖

3 討論

細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）在細胞有絲分裂過程中發揮作用，是促進肝細胞癌發生的主要的基因之一，CDK1 表達上調促進肝細胞癌增殖失控，與肝細胞癌的組織病理學分級和進展密切相關。cyclin B1 是細胞周期蛋白B1（CCNB1）表達的蛋白，其與CDK1 結合后，在細胞G2/M 期發揮作用，驅動細胞周期時相轉換，是促使細胞有絲分裂的關鍵因子。研究發現：與癌旁組織相較，肝癌組織中CCNB1 蛋白表達水平明顯上調，抑制CCNB1蛋白表達后肝癌細胞增殖能力明顯降低［14］，細胞周期蛋白B2（CCNB2）屬于B 類細胞周期蛋白家族，CCNB1 和CCNB2 共同完成促發細胞進入G2/M期中的重要功能。CCNB2 可能通過增加JAG1 的表達而加速HCC 細胞的增殖和轉移［15］。HCC 的多種細胞系激光激酶A（AURKA）表達升高，且與HCC 分級和分期密切相關。敲除Aurora-A 可抑制HepG2 細胞增殖,促進其凋亡［16］。周期素依賴性激酶抑制因子3（CDKN3）基因在肝癌中表達上調，引起細胞周期失去正常調控，導致肝癌的發生，并且在肝癌發展過程中可能發揮重要作用［17］。桿狀病毒凋亡抑制蛋白5（BIRC5）屬于凋亡抑制蛋白家族，結構簡單，是目前抗凋亡作用最強的蛋白分子。BIRC5 在肝癌細胞中呈高表達，其表達水平與腫瘤預后有相關性［18］，核分裂周期蛋白80 (NDC80)在肝細胞癌組織中表達明顯高于相應的臨近組織［19］。爪蟾驅動樣蛋白2 靶向蛋白（TPX2）在細胞有絲分裂過程中起了重要作用，TPX2 基因嚴格調控極光激酶A（Aurora-A）的活性，精確控制細胞有絲分裂進程，在肝細胞癌的增殖凋亡過程中有重要作用［20］。異常紡錘體樣小頭畸形相關蛋白（ASPM）基因在肝癌樣本中表達上調，且與腫瘤侵襲性顯著相關。ASPM 通過拮抗自噬介導的Dvl2 降解激活Wnt/β-catenin 信號傳導，促進肝細胞癌進展［21］。雌激素受體（ESR）是一類配體活化的轉錄調節因子，ESR1 基因組學的變異可能促進HBV 相關HCC 的發生。ESR1 表達增加對總體生存有保護作用，當女性缺乏編碼雌激素受體-α 的ESR1 時,二乙基亞硝胺誘導肝癌發生的程度明顯更大［22］。

本研究針對乙型肝炎相關肝細胞癌的預測中藥主要可以分為以下幾類：清熱解毒（冬凌草、半枝蓮、蟾酥、白花蛇舌草、苦參、山慈菇等），理氣和中（九香蟲、蠶沙、香櫞等），溫陽散寒（吳茱萸、干姜、高良姜、補骨脂、菟絲子等），殺蟲藥（雷丸、使君子等）。紹峰等［23］將原發性肝癌分為幾個基本證候：肝膽濕熱、（肝）氣滯血瘀、（腎）陽虛水停、（胃腸）陰虛證。由此可見，臨床診療肝癌當以清熱解毒，溫陽散寒，理氣和中等為主?，F代藥理和臨床研究發現清熱解毒主要有抑制腫瘤的增值和侵襲，增強放化療療效，減輕患者癥狀的作用［24］。中醫認為陽虛氣化不足，內生寒邪，“痰、濕、濁、毒、瘀”互結，形成腫塊。因此陽虛寒凝為肝癌的核心病機，當以扶陽為基本治法。溫陽散寒為主的中藥如吳茱萸、干姜、仙茅、補骨脂、淫羊藿等，實驗證實可以直接抑制或破壞肝癌細胞，抑制血管形成，誘導腫瘤細胞凋亡［25］。臨床運用中藥治療肝細胞癌時，于寒涼之中加入少量辛溫之品，如淫羊藿、桂枝、干姜等，即可佐制清熱解毒藥的寒涼，又可助陽化氣，溫化癌毒，更好發揮中藥抗癌功效。在肝癌治療過程中當注重健脾理氣，肝脾同治。肝癌病位在肝，涉及脾肺腎，尤其要重視脾胃，在肝癌發生發展的各個階段，都可出現脾虛氣滯，在治療肝癌的中藥處方中，加用九香蟲、蠶沙、香櫞等理氣和中藥物，有助于調和肝脾，從而減輕患者癥狀，提高臨床療效。

本研究預測得到中藥有43 種，大多是臨床常用的藥品，其中少部分中藥如野馬追、木鱉子、土木香、狼毒、救必應、使君子、雷丸等臨床極少運用。分析原因可能與醫家用藥習慣，非藥房常備藥等有關，同時這些中藥均有一定的毒性。本研究探討了其治療肝癌的可能機制，下一步將通過現代藥理學和臨床研究，明確其療效與安全性。

本研究發現乙型肝炎相關肝細胞癌發生關鍵基因 有CDK1，CCNB1，AURKA，CCNB2，CDKN3，BIRC5，ESR1，NDC80，TPX2，ASPM。除ESR1 在肝癌組織表達下降之外，其他9 個關鍵基因均在肝癌組織表達上調，預測得到43 味中藥，經系統評價分析證實了其有效性。