基于Box-Behnken 設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化白斑酊浸漬工藝及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

王文，許時貴，付志媛，魏鑫華，張國松

1.江西省皮膚病專科醫(yī)院，江西省皮膚病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心分中心建設(shè)單位，江西 南昌 330001；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330006

白斑酊收載于南京市衛(wèi)生局主編的《醫(yī)院制劑規(guī)范》［1］，為臨床經(jīng)驗方，由補(bǔ)骨脂、菟絲子、梔子3 味中藥以1∶1∶1 的比例構(gòu)成，主要用于治療白癜風(fēng)［2-3］、皮膚白斑等。該處方在臨床上使用多年。使用本品時，需將相同重量的3 味藥材用適宜濃度的乙醇浸漬7～10 d 后方可使用，且浸漬時間長，操作煩瑣，患者依從性差。而且由于患者操作水平的不同，造成工藝不穩(wěn)定，藥品的質(zhì)量得不到保證，影響藥物療效。本研究根據(jù)白斑酊處方組成、有效成分的性質(zhì)，保持原劑型（酊劑）不變的情況下，使用單因素考察結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計-響應(yīng)面法進(jìn)行實驗，優(yōu)化浸漬工藝，在保證原組方中治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)未發(fā)生變化的情況下優(yōu)化了制劑生產(chǎn)工藝，保證了制劑的穩(wěn)定、安全、有效。

1 儀器和試藥

Agilent 1260 高效液相色譜儀（配備紫外檢測器，四元梯度泵，安捷倫數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)）。補(bǔ)骨脂素對照品（批號110739-200814）、異補(bǔ)骨脂素對照品（批號110738-200511）、梔子對照藥材（批號120986-201108）、梔子苷對照品（批號110749-200714）均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法和結(jié)果

2.1 浸漬工藝研究

2.1.1 補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量測定方法補(bǔ)骨脂為該處方的君藥，是治療白癜風(fēng)常用的中藥。其主要活性成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，具有較強(qiáng)鎮(zhèn)靜、解痙、止血等作用，是補(bǔ)骨脂治療白癜風(fēng)的有效成分［4］。實驗以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，進(jìn)行浸漬工藝研究。

（1）色譜條件和系統(tǒng)適用性條件。色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（50∶50）；檢測波長：246 nm；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃。理論板數(shù)按補(bǔ)骨脂素峰計算不低于3 000。

（2）溶液制備。混合對照品溶液的制備：取補(bǔ)骨脂素對照品、異補(bǔ)骨脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含補(bǔ)骨脂素14.0 μg 和異補(bǔ)骨脂素16.4 μg 的混合溶液，即得；供試品溶液制備：精密量取浸漬液1 mL，置50 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

（3）測定法。分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀，測定。

（4）陰性對照溶液的制備。處方中除去補(bǔ)骨脂的其余藥味按制劑工藝制備，制得供試品陰性對照，照供試品溶液制備的方法制得供試品陰性對照溶液。分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液與陰性對照溶液各10 μL，按上述色譜條件測定，結(jié)果陰性對照溶液色譜在與對照品溶液色譜和供試品色譜相應(yīng)位置上無對應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，說明該方法專屬性良好，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 高效液相色譜圖：A.供試品溶液；B.混合對照品溶液；C.陰性對照溶液

（5）線性范圍考察。精密吸取混合對照品溶液2 μL、5 μL、8 μL、10 μL、15 μL、20 μL（分別含補(bǔ)骨脂素對照品0.028 μg、0.070 μg、0.112 μg、0.140 μg、0.210 μg、0.280 μg 和異補(bǔ)骨脂素對照品0.033 μg、0.082 μg、0.131 μg、0.164 μg、0.246 μg、0.328 μg）分別注入色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，并以峰面積（Y）對補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。補(bǔ)骨脂素線性方程為：Y=8 985.5X-2.142 9，r=1.000 0；異補(bǔ)骨脂素線性方程為：Y=10 585X-4.643 7，r=1.000 0。表明補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在各自進(jìn)樣量范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

（6）精密度試驗。精密吸取混合對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次,測得補(bǔ)骨脂素對照品峰面積平均值為1 257.25，RSD 為0.17%；測得異補(bǔ)骨脂素對照品峰面積平均值為1 732.97，RSD 為0.18%，說明該方法精密度良好。

（7）穩(wěn)定性試驗。取供試品溶液10 μL，按擬定的含量測定項下方法分別在0、2、4、8、16、24 h 測定，結(jié)果補(bǔ)骨脂素峰面積平均值為699.07，RSD（n=6）為0.53%；異補(bǔ)骨脂素峰面積平均值為604.86，RSD（n=6）為0.49%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

（8）重復(fù)性試驗。按擬定的含量測定方法，取同一批樣品平行制備6 份供試品溶液，測得補(bǔ)骨脂素峰面積平均值為696.88，RSD（n=6）為0.66%；異骨脂素峰面積平均值為600.74，RSD（n=6）為0.20%，表明方法重復(fù)性良好。

（9）加樣回收率試驗。取已知含量的樣品（補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量分別為0.389 0 mg/mL、0.286 0 mg/mL）1 mL，精密加入補(bǔ)骨脂素對照品和異補(bǔ)骨脂素對照品混合溶液1 mL(補(bǔ)骨脂素濃度為0.392 2 mg/mL、異補(bǔ)骨脂素濃度為0.300 5 mg/mL)，按供試品制備與測定方法，平行做6 份，計算得補(bǔ)骨脂素回收率為101.75%，RSD 為0.63%；異補(bǔ)骨脂素回收率為101.21%，RSD 為0.36%，結(jié)果見表1、表2。說明該方法準(zhǔn)確度良好。

表1 補(bǔ)骨脂素回收率測定結(jié)果

表2 異補(bǔ)骨脂素回收率測定結(jié)果

（10）補(bǔ)骨脂藥材含量測定。取補(bǔ)骨脂藥材粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取2 h，放冷，轉(zhuǎn)移至100 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液5 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。精密吸取10 μL 進(jìn)樣，測得藥材中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的總含量為1.26%。

2.1.2 單因素考察白斑酊處方為：補(bǔ)骨脂60 g、菟絲子60 g、梔子60 g。

（1）原料粉碎粒度。稱取處方飲片3 份，分別粉碎，過20 目、30 目、40 目篩，70%乙醇料液比9∶40，浸漬7 d，按上述方法測得浸漬液中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總轉(zhuǎn)移率分別為43.37%、57.21%、68.35%。結(jié)果表明，隨著粉碎粒度增加，總轉(zhuǎn)移增加，確定粉碎過篩目數(shù)為40 目。

（2）浸漬溫度。稱取處方飲片3 份，粉碎，過40 目篩70%乙醇料液比9∶40，分別在20℃、30 ℃、40℃條件下浸漬7 d，按上述方法測得浸漬液中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總轉(zhuǎn)移率分別為65.25%、65.38%、66.21%。結(jié)果表明，隨著浸漬溫度升高，總轉(zhuǎn)移無明顯變化，說明浸漬溫度對浸漬工藝的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

（3）乙醇濃度。稱取處方飲片5 份，粉碎過40 目篩，用濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%乙醇800 mL 浸漬7 d，按上述方法測得浸漬液中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總轉(zhuǎn)移率分別為43.25%、62.03%、68.35%、68.56%、69.03%。結(jié)果表明，隨著乙醇濃度的升高，總轉(zhuǎn)移率升高，在60%后總轉(zhuǎn)移率基本不再增加，故乙醇濃度以60%、70%、80%為考察對象。

（4）料液比。稱取處方飲片5 份，粉碎過40目篩，分別用500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL 70%濃度的乙醇浸漬7 d，即料液比為9∶25、9∶30、9∶35、9∶40、9∶45，按上述方法測得浸漬液中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總轉(zhuǎn)移率分別為43.13%、51.08%、68.55%、72.98%、78.25%。結(jié)果表明，隨著料液比的升高，總轉(zhuǎn)移率增加，在料液比9∶35 后總轉(zhuǎn)移率基本不再增加，故料液比以9∶35、9∶40、9∶45 為考察對象。

（5）浸漬時間。稱取處方飲片4 份，粉碎過40目篩，分別用700 mL 的70%濃度的乙醇浸漬5、7、9、11 d，按上述方法測得浸漬液中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總轉(zhuǎn)移率分別為48.26%、68.55%、71.27%、72.43%。結(jié)果表明，隨著浸漬時間的增加，總轉(zhuǎn)移率增加，在7 d 后總轉(zhuǎn)移率基本不再增加，故浸漬時間以7、9、11 d 為考察對象。

2.1.3 Box-Behnken 設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化浸漬工藝（1）響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果。在單因素實驗基礎(chǔ)上，原料粉碎過篩目數(shù)固定為40 目，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）、浸漬時間（C）為自變量，每個自變量的低、中、高水平以-1、0、1 進(jìn)行編碼，以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總轉(zhuǎn)移率%（Y）為響應(yīng)值，使用Design-Export.V12 軟件進(jìn)行Box-Behnken 中心點(diǎn)試驗設(shè)計［5］，因素水平及編碼見表3，實驗安排及結(jié)果見表4。

表3 試驗因素水平

表4 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果

利用ANOVA 分析響應(yīng)面回歸參數(shù)，采用Design-Export.V12 軟件對表6 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸擬合，得二次多項回歸模型方程Y=77.26+2.47A+5.21B+2.44C+2.79AB-0.1975AC-0.57BC-3.27A2+3.04B2-4.58C2

（2）方差分析。經(jīng)過軟件分析，模型的F=5.91，P=0.014 3（P＜0.05），R2=88.38%，說明該模型擬合結(jié)果較為理想。通過分析A（乙醇濃度）、B（料液比）、C（浸漬時間）三因素對補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總轉(zhuǎn)移率的影響順序為B＞A＞C，其中，B 對結(jié)果的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各因素交互影響的順序為AB＞BC＞AC，但其對結(jié)果影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。除了B 外，其他因素對該模型的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），證明各項因素與補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總轉(zhuǎn)移率不是簡單的線性關(guān)系。失擬態(tài)F=5.95，P=0.087 3，表明無失擬因素存在。方差分析結(jié)果詳見表5。

表5 方差分析結(jié)果表

（3）浸漬工藝的響應(yīng)面結(jié)果分析。根據(jù)實驗結(jié)果，進(jìn)行回歸分析后，作出響應(yīng)曲面圖，如圖2 所示。使用Design-Export.V12 對浸漬工藝的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)模型擬合結(jié)果，白斑酊浸漬工藝為加74.93%乙醇，料液比9∶45，浸漬9.28 d，此條件的總轉(zhuǎn)移率的預(yù)測值為87.463%。結(jié)合實際操作的可行性和簡便性，最終確定了其最佳浸漬工藝，70%乙醇，料液比9∶45，浸漬9 d。

圖2 ABC三因素對總轉(zhuǎn)移率的響應(yīng)面圖

2.1.4 驗證實驗為了驗證優(yōu)化后工藝（70%乙醇，料液比9∶45，浸漬9 d）的可靠性及穩(wěn)定性，按處方比例，稱取藥材3 份，每份180 g，按優(yōu)化后工藝條件浸漬，按上述含量測定方法測定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總量，計算補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表6。

表6 工藝驗證結(jié)果表

結(jié)果表明，3 份驗證樣品的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素平均總轉(zhuǎn)移率為88.18%，工藝參數(shù)穩(wěn)定。

2.2 白斑酊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

2.2.1 薄層色譜鑒別（1）方中補(bǔ)骨脂的薄層色譜鑒別，參考《中國藥典》2020 年版一部補(bǔ)骨脂【鑒別】項下方法及文獻(xiàn)資料對方中補(bǔ)骨脂進(jìn)行鑒別［6-7］，以補(bǔ)骨脂素對照品和異補(bǔ)骨脂素對照品混合液為對照，結(jié)果供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰且對應(yīng)良好，陰性無干擾（如圖3 所示）。

圖3 補(bǔ)骨脂薄層色譜（365 nm）

（2）方中梔子的薄層色譜鑒別，參考《中國藥典》2020 年版一部中梔子【鑒別】項下的薄層色譜方法進(jìn)行鑒別［6］。結(jié)果供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰且對應(yīng)良好，陰性無干擾（如圖4 所示）。

圖4 梔子薄層色譜顯色圖

2.2.2 含量測定取白斑酊的3 批中試產(chǎn)品同“2.1.3”項下補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量測定方法制備，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，按色譜條件測定。結(jié)果：白斑酊的3 批中試產(chǎn)品的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總含量分別為：0.677 9 mg/mL、0.678 7 mg/mL、0.677 8 mg/mL。

3 討論

本次實驗以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的總轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，使用單因素考察結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計-響應(yīng)面法考察了白斑酊的最佳浸漬工藝，對其中的補(bǔ)骨脂及梔子進(jìn)行了薄層色譜鑒別，并檢測了酊劑中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總含量，為白斑酊品種的開發(fā)提供了依據(jù)。