阿特匹林C生物合成與活性研究進展

李恩楷，類成智，朱登軒，劉昱婷 綜述 劉成偉 審校

東北林業大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040

巴西綠蜂膠是蜜蜂從植物的樹皮、芽等分泌液中收集到的一種類似樹脂的營養物質，含有豐富的生物活性化合物[1]，其中阿特匹林C(3，5-異戊烯基-4-羥基肉桂酸)是從巴西綠蜂膠中所提取出來的一種異戊烯基化香豆素類衍生物，具有抗腫瘤、免疫調節、促進脂肪代謝等多種生物活性。1998年KUMAZAWA等[2]通過觀察巴西東南部卡瓦略波利斯市附近生活的蜜蜂行為，利用攝像設備，確定了蜜蜂采食的對象是酒神菊屬的一種植物Baccharis dracunculifolia，并且通過液相色譜-質譜等方法驗證了綠蜂膠和B.dracunculifolia的乙醇提取物色譜圖高度相似，表明綠蜂膠的活性成分來自于蜜蜂所采食的植物。為闡明阿特匹林C的生物合成機制和生物活性，本文將對其相關研究結果進行綜述。

1 生物合成

阿特匹林C的分子式為C19H24O3，相對分子質量為300.4 g/mol，分子結構如圖1所示。目前，關于阿特匹林C的生物合成路徑已經基本闡明[3-5]。其合成起始于葡萄糖，如圖2所示，葡萄糖首先在體內通過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑分別合成磷酸烯醇式丙酮酸和赤蘚糖-4-磷酸，之后在DAHP合成酶的作用下合成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)，DAHP通過莽草酸途徑合成酪氨酸和苯丙氨酸，前者可以在TAL基因編碼的酪氨酸解氨酶的作用下直接脫去氨基合成對香豆酸。而后者則在PAL基因編碼的苯丙氨酸解氨酶作用下發生消除反應，脫去氨基，形成肉桂酸。在C4H和CPR基因分別編碼的香豆酸-4-羥化酶和細胞色素P450還原酶的協同下，在肉桂酸4號位發生羥基取代反應，合成對香豆酸。對香豆酸在AcPT1基因編碼的異戊烯基轉移酶的作用下，在碳3號位和5號位發生異戊烯基取代反應，生成阿特匹林C。其中只發生一次異戊烯基取代反應的化合物是Drupanin。異戊烯基供體的合成通常來自萜類化合物的合成途徑，包括2-甲基赤蘚醇磷酸途徑和甲羥戊酸途徑。阿特匹林C分子上的異戊烯基源于后者途徑合成。2002年，UTO等[6]成功化學合成了阿特匹林C。2019年，MUNAKATA等[5]從菊科植物Artemisia capillaris中發現了異戊烯基化轉移酶AcPT1，他們將編碼該酶的AcPT1基因轉入酵母，在加入底物對香豆酸的情況下，成功異源生產了阿特匹林C。

圖1 阿替匹林C的分子結構

圖2 阿特匹林C的生物合成途徑

2 生物活性

2.1 抗腫瘤活性 眾所周知，腫瘤是人類健康的最大殺手之一。世界衛生組織發布的世界癌癥報告指出，2016年，全球有450萬人死于腫瘤[7]。腫瘤能轉移和存活的主要原因之一是通過誘導血管形成，進而從血液中獲得生長所需的養分[8]。AHN等[9]在其研究中發現阿特匹林C可以通過減少VE-鈣黏蛋白(VE-CAM)和血小板內皮細胞黏附分子(PECAM-1/CD31)的生成，抑制毛細血管的形成。同時，他們發現隨著阿特匹林C濃度增大，人臍靜脈內皮細胞的凋亡率依次升高，50μg/mL的阿特匹林C即可誘導53%人臍靜脈內皮細胞凋亡，是對照組的2.8倍。Western Blot結果說明，阿特匹林C誘導抑制血管生成作用可能是阻斷了細胞外調節蛋白激酶(ERK)信號轉導通路，且激活了天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)來誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡。除了抑制血管形成，阿特匹林C對多種癌細胞有直接或間接的抑制作用。ENDO等[10]在研究中發現150μmol/L的阿特匹林C能夠殺死75%以上的前列腺癌細胞，同時阿特匹林C可以顯著的提高自噬活性物(LC3-Ⅱ)的表達水平，促進前列腺癌細胞自噬。阿特匹林C與自噬抑制劑聯合作用將上調絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)和3(RIPK3)的表達，誘導前列腺癌細胞壞死性凋亡。SHIMIZU等[11]通過對小鼠皮下注射氧化偶氮甲烷(AOM)誘導癌變，同時以10 mg/kg劑量飼喂小鼠阿特匹林C，培養28 d后進行檢測，發現相比于對照組，癌前病變—結腸異常隱窩病灶(ACF)的發生率下降了43.4%。由于50%以上的結腸癌是由Rac蛋白突變引起，這種突變導致P21激活激酶1(PAK1)的異常激活[11]。MESSERLI等[12]進一步研究推測阿特匹林C抑制腫瘤生長的機制可能是通過阻止PAK1在141位絲氨酸的自動磷酸化，進而阻止Rac蛋白所誘導的PAK1活化，使腫瘤的生長受到抑制。除此之外，PAK1也在免疫抑制和肺纖維化中起作用[13]，阿特匹林C對PAK1活化的抑制作用以及其抗炎活性可以讓它有潛力用于冠狀病毒引起的疾病如新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的治療[3]。KOBAL等[14]在研究中發現阿特匹林C對口咽癌細胞的生長有顯著抑制作用，157μmol/L的濃度即可使50%的口咽癌細胞細胞生長受到抑制。其機理可能是由于阿特匹林C通過和二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸(DPPS)以及二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)相互作用，誘導巨型磷脂囊泡(GUV)的聚集，改變細胞膜的通透性，導致細胞壞死。PANG等[15]發現阿特匹林C對人口腔鱗癌細胞有顯著抑制作用，50μmol/L阿特匹林C處理24 h，體系中生存素蛋白的含量下降超過55%，200μmol/L處理24 h，則體系中生存素蛋白的含量下降超過80%。他們還發現除了影響生存素含量外，阿特匹林C對癌細胞的抑制作用還與促進釋放細胞凋亡的酶有關。SOUZA等[16]及其團隊發現阿特匹林C對所有的宮頸癌細胞株都有明顯的細胞毒性。細胞內源性凋亡存在兩個明顯現象：一是線粒體膜電位的降低，這將抑制凋亡因子從胞漿中降解；二是脂質過氧化的發生，這將導致細胞不飽和脂質結構的損傷。實驗結果顯示體系中存在阿特匹林C情況下，各個宮頸癌細胞株線粒體膜電位顯著降低、脂質過氧化水平顯著提高。海拉細胞系在72 h的處理下，僅9μmol/L的阿特匹林C處理即可抑制半數海拉細胞系(HeLa)的生長，證明阿特匹林C可以通過誘導細胞內源性凋亡的方式抑制宮頸癌細胞的生長。KIMOTO等[17]和AKAO等[18]發現阿特匹林C對T、B淋巴細胞、髓系、單核細胞等白血病細胞株有顯著的細胞毒或誘導凋亡作用[17-18]。其中對粒細胞系和T淋巴細胞系的抑制作用顯著，51.6μmol/L濃度的阿特匹林C處理即可抑制半數人急性早幼粒白血病細胞(HL-60)的生長[18]。在電鏡下可以觀測到各種腫瘤細胞出現凋亡小體和DNA片段化，而正常的T淋巴細胞則無此現象[17]，這說明白血病細胞DNA合成受到明顯抑制，而正常T淋巴細胞則受抑制有限，證明阿特匹林C對白血病細胞尤其是粒細胞系和T淋巴細胞系存在明顯的生長抑制作用。綜上所述，阿特匹林C可以通過不同機制對廣譜癌細胞的生長產生抑制作用(表1)，這為抗癌藥物研發提供了候補天然產物。

表1 阿特匹林C的抗腫瘤活性

2.2 免疫調節活性 阿特匹林C在適應性免疫調節方面表現出良好的作用。CHEUNG等[19]通過羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯染色法(CFSE)和流式細胞儀確定了阿特匹林C能抑制CD4陽性細胞的活化與增殖，并抑制釋放白細胞介素(IL)、干擾素(IFN)等細胞因子，降低免疫排斥的發生。一旦清除體系中的阿特匹林C，抑制作用迅速消失，細胞重新開始活化增殖，這表明阿特匹林C的抑制作用是可逆的，可以利用其在器官移植方面單獨或作為輔助藥物以達到減少免疫排斥的目的。KIMOTO等[20]發現，通過阿特匹林C處理的體系CD4陽性與CD8陽性細胞數的比值和輔助T細胞總數也都有增加，這些發現表明阿特匹林C能調節適應性免疫。在固有性免疫調節方面，阿特匹林C也能發揮重要作用。研究采用角叉菜膠誘導的小鼠炎癥模型，觀察阿特匹林C的抗炎作用，角叉菜膠能誘導前列腺素E2的分泌，導致白細胞的聚集與炎癥的發生[21-22]。在10 mg/kg的阿特匹林C劑量的預先注射下，再在小鼠足部注射角叉菜膠，結果顯示，前列腺素E2的分泌下降了58%，白細胞數下降了近80%，這些結果說明了阿特匹林C有顯著的固有性免疫調節活性。

2.3 脂肪代謝活性(圖3) 肥胖是現代人常見的健康問題之一，1979—2016年，20歲以上的婦女肥胖數從0.7億人增加到3.9億，男性肥胖數從0.3億增加到2.8億[23]。肥胖是當人體攝入的熱量大于消耗的熱量時，多余的熱量以脂肪尤其是甘油三酯的形式儲存于體內的白色脂肪細胞中，使人體質量過度增長并有可能引起一系列生理疾病的過程。RICQUIER等[24]研究發現質子載體解偶聯蛋白1(UCP1)是一種定位于米色脂肪細胞線粒體上的一種獨特的膜蛋白，它在適應性產熱中發揮作用。UCP1解開呼吸與ATP合成的偶聯，使能量以熱量形式耗散，促進脂肪酸的氧化水平的提高，增加機體的產熱效應。除此之外，KAZAK等[25]發現了肌酸無效循環這一UCP1蛋白非依賴性的特殊產熱方式，也有利于增加機體的產熱。NISHIKAWA等[26]最初發現以10 mg/kg阿特匹林C的劑量飼喂小鼠后，小鼠的UCP1的mRNA表達量上升了近12倍，蛋白表達量也上升了近2.5倍，這說明阿特匹林C能促進脂肪代謝，增加機體產熱效應。阿特匹林C還能延長PR結構域蛋白16(PRDM16)半衰期，這將誘導白色脂肪細胞轉變為米色脂肪細胞。他們通過免疫印跡分析發現在10μmol/L阿特匹林C誘導分化的小鼠胚胎成纖維細胞(C3H10T1/2)中，PRDM16的含量明顯上升，這說明阿特匹林C能誘導前體細胞向米色脂肪細胞分化。阿特匹林C還作為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的激動劑，可以通過提升PPARγ轉錄水平的方式上調其下游基因如脂聯素的表達，增加細胞對胰島素的敏感性從而促進細胞對脂肪酸以及甘油三酯的氧化，緩解因浸潤脂肪組織的巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導的脂聯素表達下調造成的脂肪細胞功能障礙[27-28]。NISHIKAWA等[29]的進一步研究也發現阿特匹林C還可以增加4種脂肪代謝相關蛋白的表達：一是胍基乙酸甲基轉移酶(GATM)，它是肌酸生物合成的限速酶，催化甘氨酸和精氨酸合成胍基乙酸；二是線粒體甘氨酸咪基轉移酶(GAMT)，它將胍基乙酸合成為肌酸；三是線粒體肌酸激酶2(CKMT2)，它能磷酸化線粒體中的肌酸，增強肌酸無效循環的活性；四是肌酸轉運蛋白(CrT)，它能協助肌酸向線粒體內的轉運。這4種蛋白的表達上調能加強米色脂肪細胞中的肌酸無效循環的產熱作用，消耗過多的脂肪以治療肥胖。

圖3 阿特匹林C的脂肪代謝活性

2.4 其他生物學活性 利什曼原蟲是一種嚴重損害人類健康的單細胞寄生生物，其寄生在巨噬細胞內[30]。若其侵犯內臟，則引起黑熱病；若其侵犯皮膚，則引起皮膚利什曼病[31]。ARRUDA等[32]通過實驗驗證了阿特匹林C具有抗利什曼原蟲活性。在濃度為17.46μmol/L時即可達到對50%利什曼原蟲的抑制作用，并隨著濃度的上升，抑制作用逐漸增強。同時，在200~400μmol/L的濃度下即可抑制大部分常見細菌的生長[22]，這些說明阿特匹林C有顯著抗菌抗利什曼原蟲活性。胃潰瘍是一種常見并且危害性大的疾病，它是由于各種攻擊因子使胃黏膜受損害所致[32]。胃酸分泌異常、非甾體抗炎藥、幽門螺桿菌感染等都是誘導胃潰瘍發生的關鍵攻擊因子[33]。目前PHILIPE等[34]通過實驗證實了阿特匹林C的胃黏膜保護活性。乙醇-鹽酸混合劑能削減胃黏膜的防御機制，誘發胃潰瘍，此法通常作為研究胃潰瘍的模型[35]。在喂食小鼠不同劑量阿特匹林C后，利用乙醇-鹽酸混合劑處理小鼠，實驗結果顯示，在阿特匹林C劑量達到3 mg/kg時，與對照組相比胃潰瘍面積下降近90%，超越了甘珀酸的療效，這證明了阿特匹林C的良好抗潰瘍活性。阿爾茨海默病和帕金森病是目前老年人的常見神經退行性疾病，GILGUN等[36]在2001年發現該疾病的產生與氧化應激有關。由于神經細胞外高濃度的谷氨酸或愛拉斯汀(erastin)會阻止胱氨酸的進入，使細胞內谷胱甘肽水平降低以及細胞內活性氧和脂質過氧化物的生成增加，導致神經元的凋亡[37]。而MADOKA等[38]在其研究中發現在分別使用高濃度谷氨酸和erastin的作用下，空白對照組的神經細胞存活率均低于25%，而加入10μmol/L的阿特匹林C的實驗組神經細胞存活率則接近95%。神經細胞存活率的顯著升高說明阿特匹林C有優秀的神經細胞保護作用。

3 結語

綜上所述，阿特匹林C是一種非常多能的“明星分子”。其在抗腫瘤、免疫調節，脂肪代謝等多方面都體現了非常強大的活性，在各種藥物研發上發揮了重要作用。同時，阿特匹林C也許還有更多的生物活性等待探明。但目前阿特匹林C的產量仍然很低，價格也極為昂貴，這限制阿特匹林C藥理學研究和應用。大量生產阿特匹林C是解決此問題的重要方法。直接從巴西綠蜂膠中進行提取成本太高，而在酵母中的異源生產量仍然不理想，且副產物多，因此研究者正在通過基因工程的方法提高產量。倘若能大量生產，阿特匹林C在未來有望更廣泛地應用于研究與臨床，為人類的疾病治療做出貢獻。