基于網絡藥理學探討《溫疫論》中藥防治新型冠狀病毒肺炎分子機制

李小陽，楊 樂，李 兵

(中國中醫科學院 中醫藥信息研究所，北京，100700)

《溫疫論》[1]是中國第一部系統研究急性傳染病的醫學著作。作者吳又可在《溫疫論》中創立了“戾氣”病因學說，強調瘟疫與傷寒完全不同，書中云：“夫瘟疫之為病，非風、非寒、非暑、非濕，乃天地間別有一種異氣所感”，并稱之為雜氣、戾氣、癘氣或疫氣?！稖匾哒摗诽岢鑫烈叩闹委煼▌t、辨證方藥對后世醫學影響深遠，為現代研究傳染病病因病機、理法方藥奠定了基礎[2-4]。

中醫藥積極參與新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)診療[5]，取得了良好的效果。各省市、地區針對區域和人群特點，發布了不同方案。據統計，各地防疫處方中，《溫疫論》中達原飲等方劑應用最廣[6]。另外，《溫疫論》中頻用白虎湯治療疫邪熱在氣分，此次也用于各地抗疫。仝小林院士團隊以寒濕疫的角度，效法《溫疫論》的思路，以達原飲中的厚樸、檳榔、草果開通膜原，祛除穢濁濕，進而制定了“武漢抗疫方”[7-8]。在國家《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》中，更是多次提倡、認可了中醫藥在輔助治療和預防治療中的作用，并針對不同證型分期治療推出了不同復方。針對濕熱蘊肺證，推薦處方以達原飲為基礎，加柴胡、赤芍、連翹、青蒿、蒼術、大青葉等，發揮燥濕清熱、疏利疫邪出表的作用；針對寒濕阻肺證，推薦處方為達原飲與平胃散加減方，具有順氣寬中、健脾化濕、和解表里的功效；針對疫毒閉肺證，以《溫疫論》方達原飲、桃仁承氣湯加上麻杏石甘湯、宣白承氣湯等，可清肺平喘、泄熱開閉；針對氣營兩燔證，處方以《溫疫論》中兩首犀角地黃湯合白虎湯為基礎方，加入玄參、連翹、丹皮、黃連等，可清氣涼營、熄風開竅。

隨著疫情防控逐漸常態化，目前仍未發現治療COVID-19的特效藥。本研究擬通過網絡藥理學[9]探討《溫疫論》復方的作用機制，為抗新冠肺炎藥物開發和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 數據規范及預處理

手工錄入《溫疫論》中33首處方，按照《中華人民共和國藥典》(2015版)[10]將中藥名稱進行統一，例如：將“白芍藥”統一為“白芍”，“棗仁”統一為“酸棗仁”，“真藿香”統一為“廣藿香”，“白茯苓”統一為“茯苓”，“廣陳皮”統一為“陳皮”，“生地”統一為“地黃”，“花粉”統一為“天花粉”，“草果仁”統一為“草果”，“山梔仁”統一為“梔子”，“天門冬”統一為“天冬”，“麥門冬”統一為“麥冬”，“丹皮”統一為“牡丹皮”，“瓜蔞實”統一為“瓜蔞”，“破故紙”統一為“補骨脂”，“車前”統一為“車前草”。并對所有用藥頻次、藥物四氣五味、歸經進行統計分析。

1.2 活性成分收集與篩選

在中藥系統藥理學技術平臺TCMSP[11](http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)依據藥物吸收、分布、代謝、排泄(Absorption、Distribution、Metabolism、Excretion，ADME)特性，設定口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%，且類藥性(Druglikeness，DL)≥0.18，篩選獲取活性成分。在中醫百科全書數據庫ETCM[12](http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php)檢索，補充活性成分后，構建中藥化學成分數據庫。因礦物類和動物類藥材的特殊性，故本文方法暫未將石膏、龜甲等納入分析范圍。

1.3 候選靶點庫的構建

在TCMIP(http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php)的中藥靶點預測功能模塊，通過化學成分二維結構與美國食品藥品管理局(FDA)上市藥物相似性比對[12]，選擇相似性分數≥0.8的靶點作為候選靶點。

1.4 COVID-19靶點收集

2020年3月，David E.Gordon等[13]94位專家在NATURE發表了一篇新冠病毒SARS-CoV-2蛋白與人蛋白相互作用篩選潛在治療靶點的文章，研究人員在人類細胞中克隆、標記和表達了SARS-CoV-2的29個蛋白中的26個，并通過親和純化質譜法(AP-MS)共鑒定出332種高度可信的與病毒蛋白相互作用的人蛋白(PPIs)，其中有66種可藥物化的靶點。論文經發表后被引用已近600次。本文中使用的COVID-19靶點來源于文章公布的SARS-CoV-2蛋白互作圖譜數據中332個與SARS-CoV-2關聯的人類靶標數據。

1.5 復方-藥物-活性成分-靶點-疾病網絡構建

利用Cytoscape 3.7.2[14]網絡可視化軟件，構建《溫疫論》“復方-藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡。

1.6 潛在靶點通路分析

本研究使用Metascape[15](https：//metascape.org/gp/index.html)進行靶標的功能富集分析和信號通路分析，并構建網絡篩選關鍵靶標節點。GO富集分析主要涵蓋生物學的3個方面：生物過程(BP)、分子功能(MF)及細胞組分(CC)。京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)可對藥物作用靶點或差異表達基因進行信號通路分析。

2 結果

2.1 數據規范及預處理

2.1.1 中藥頻次統計 納入分析的33例處方中，單味藥累計用藥195次，共包含單味中藥70種。單味藥最高使用次數16次，最低使用1次，使用頻次前十的中藥為：白芍、甘草、當歸、大黃、知母、陳皮、地黃、厚樸、柴胡、黃芩。具體情況見表1。

表1 《瘟疫論》中藥頻次統計

2.1.2 中藥屬性統計 《溫疫論》方劑中所用藥物藥性主要為溫、微寒、寒、平，其中溫性藥物所占比例最高為30%，其次為微寒、寒、平，分別為22%、21%、17%；所用藥物五味主要為甘、辛、苦，其中甘味藥所占比例最大為28%，其次為辛、苦所占比例分別為26%、24%；所用藥物中歸肺經藥物所占比例最大為20%，其次為脾、胃、肝、腎、心經，占比分別為15%、14%、13%、11%、11%。見圖1。

圖1 中藥屬性統計

2.2 藥物活性成分及靶點

經過篩選和刪除重復項后，以藥物為單位，涉及活性化合物來源及預測靶點個數見表2。

表2 藥物活性成分及靶點數

續表2

續表2

2.3 “復方-藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡構建

由于涉及的活性化合物及靶點數較多，將網絡中不含藥物靶標的化合物及其他靶點剔除，簡化后的網絡包含480個節點，1 578條邊(圖2)。其中方劑節點33個，以圓形代替；藥物節點70個，以三角形代替；化合物節點342個，以菱形代替；病毒靶點節點34個，以方形代替；邊表示節點之間的相互作用關系(見圖5)。由圖中可以看出，中藥存在同一化合物作用于多個靶點和多個化合物作用于同一靶點的現象，體現了中藥多成分多靶點共同作用的內涵。將各復方中中藥、活性成分及其作用靶點信息作為節點(node)直接導入，以邊(edge)作為中藥、成分和靶點的相互關系，每個節點的重要性則通過拓撲參數度數進行評估。節點度值為與節點相連邊的數量，度值越大，表明該節點在網絡中越重要(degree)，一般認為節點度值大于該類節點度值中位數2倍的節點為網絡中的關鍵節點。根據網絡拓撲學性質度值排序后，符合上述要求的關鍵藥物節點12個及其度值分別為：黃芩(52)、甘草(50)、大黃(37)、白芍(34)、瓜蔞(29)、紫蘇子(29)、柴胡(28)、檳榔(25)、茵陳(24)、大棗(23)、當歸(20)、茯苓(20)；關鍵化合物節點45個，前15名及其度值分別為豆甾醇(21)、三磷酸腺苷(20)、棕櫚酸(19)、谷甾醇(18)、十八酸(15)、槲皮素(15)、亞油酸(13)、黃芩苷(13)、腺苷(12)、胡蘿卜甾醇(12)、肉豆蔻酸(11)、10，13-二十碳二烯酸(11)、鳥苷(10)、二十四烷酸(10)。

圖2 “復方-藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡

2.4 “靶點-功能-通路”網絡分析

由于靶點數較少，將minioverlap值設置為1，導出Metacape分析結果至Cytoscape 3.7.2軟件，構建“靶點-功能-通路”關聯網絡。Metascape中GO功能富集分析得到GO條目625個(P<0.01)，其中生物過程(BP)條目476個，細胞組成(CC)條目54個，分子功能(MF)條目95個，分別占76%、9%、15%，KEGG通路富集篩選得到56條信號通路(P<0.01)，見圖3。根據拓撲學參數，篩選網絡中同時滿足BC、CC、degree值大于均值的10個關鍵靶點，為RHOA、HMOX1、PRKACA、ACSL3、SCARB1、ARF6、PPT1、HDAC2、RAB7A、POR。

圖3 “靶點-功能-通路”關聯網絡

Metascape的Mcode聚類結果分別篩選出GO功能富集分析中三個方面及KEGG中排名靠前的功能和通路，結果見圖4。

注：A：細胞組成；B：分子功能；C：生物過程；D：KEGG。圖4 GO與KEGG分析

3 討論

分析《溫疫論》復方中藥物的性味歸經發現，復方重點作用于肺經、脾經，辛味、苦味和甘味藥比例最大，藥物溫性、平性和寒性各有分布，該結果與《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》推薦復方的用藥規律一致[16]。根據統計結果顯示，《溫疫論》中高頻用藥包括白芍、甘草、當歸、大黃、知母、陳皮、地黃、厚樸、柴胡、黃芩。其中黃芩、甘草、大黃、白芍、柴胡、當歸為“復方-藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡中篩選的關鍵藥物節點；豆甾醇、三磷酸腺苷、棕櫚酸、谷甾醇、槲皮素、亞油酸、黃芩苷、腺苷、胡蘿卜甾醇、肉豆蔻酸、10，13-二十碳二烯酸、鳥苷為關鍵化合物節點。

黃芩為COVID-19中醫藥治療用藥組方中最常用的藥物[17]，典型應用如清肺排毒湯、達原飲、小柴胡湯等方劑及中成藥。研究表明，黃芩苷和黃芩素是非共價、非多肽性的SARS-CoV-2 3CLpro抑制劑，它們可以有效抑制新冠病毒中一種重要的蛋白酶3CLpro的復制[18]。根據李婧等[19]的研究，柴胡、甘草、金銀花等中藥也含有較多潛在抗SARS-CoV-2活性成分。馬婧等[20]采用DS中CDOKER對TCMD數據庫中成分進行分子對接虛擬篩選，基于PLP靶點篩選得到的中藥為白芍、當歸、瓜蔞等，宗陽[21]和龔宇晟等[22]分子對接結果顯示豆甾醇、槲皮素、谷甾醇等化合物與COVID-19推薦用藥的親和力相似。

通過“靶點-功能-通路”網絡，篩選出10個關鍵靶點為RHOA、HMOX1、PRKACA、ACSL3、SCARB1、ARF6、PPT1、HDAC2、RAB7A、POR。血紅素加氧酶(HMOX1)是一種可催化血紅素降解過程中的關鍵酶，具有細胞保護作用，研究證明[23]過量的游離血紅素可誘導細胞凋亡。HMOX1在肺中高度表達[24-25]，并且已被證明對小鼠中有介導白細胞介素10(IL-10)的抗炎作用，還牽涉包括心肌梗死、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等多種病理狀態[26-27]。它的上調已被證明具有抵抗HIV、DENV、HCV和IAV感染產生的氧化應激的保護作用[28]。由于SARS-CoV-2感染會嚴重影響呼吸道的侵襲性炎癥反應，因此在病毒感染期間進一步探索HMOX1功能將有助于闡明病毒的發病機理和可能的治療方法[29]；RHOA是小型GTPases Rho家族的成員，激活對于肺損傷至關重要，也是TNF信號傳導途徑和MAPK信號傳導途徑中最重要的蛋白之一。He B[30]的研究證明抑制RHOA是治療急性肺損傷有效的方法；Pinto BGG等[31-32]應用系統生物學方法證實包括HDAC2等與組蛋白修飾相關的基因是人肺ACE2上調的潛在靶點；Ghosh S[33]研究發現RAB7A基因的缺失可以通過改變內質體的運輸，將ACE2受體隔離在細胞內，從而減少病毒進入；Ackerman EE[34]利用SARS-CoV-2-宿主蛋白相互作用網絡識別在感染后驅動細胞整體行為中具有獨特作用的蛋白質，認為SCARB1等預測出的8種蛋白質有可能成為病毒特異性藥物靶點，并應被優先用于藥物再利用。

基于冠狀病毒的復制過程，目前針對ACE2抑制劑、核苷類似物、膜融合抑制劑、蛋白酶抑制劑(HIV蛋白酶、TMPRSS2絲氨酸蛋白酶、3Clpro蛋白酶)等不同靶點成為研發篩選抗SARS-CoV-2潛在治療藥物的主要策略[35]。

《溫疫論》復方通過調控Ras蛋白活性、GTPase活性、GDP結合和GTP結合通路，影響ACE2在細胞中的表達。Lukassen S等[36]研究了ACE2和TMPRSS2的表達水平及其在肺組織中跨細胞類型的分布。在節段性支氣管分支中，ACE2主要在瞬時分泌細胞中表達，這些細胞顯示出豐富的與RHO GTP酶功能和病毒過程相關的途徑。RHO-GTPase激活CIT和病毒調節途徑，即與膜重塑或免疫系統相關的過程，在瞬時分泌細胞中強烈富集。Ras蛋白也是一種gtpase，作為信號通路的分子開關調節細胞增殖、存活、生長、遷移、分化或細胞骨架動力學。Ras蛋白通過在不活躍的GDP結合態和活躍的GTP結合態之間循環傳遞來自細胞外生長因子的信號。

核苷酸是多種生命活動所必須的有機小分子，除嘌呤核苷酸合成和分解代謝過程中的部分酶參與病毒感染的發生發展外，還可以通過對代謝酶的競爭性抑制作用干擾或抑制嘌呤核苷酸的合成[37]。目前的研究中有大量重點放在核苷酸抑制劑上，如Sofosbuvir，Ribavirin，Remidisvir，IDX-184等，可以競爭病毒RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)活性位點，滲透到病毒新合成的RNA鏈中，從而中斷了病毒基因組的合成[38]。此外，《溫疫論》復方還參與了aminoacyl-tRNA、protein disulfide oxidoreductase、S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase等多種連接酶、轉移酶活性以及輔酶的合成等功能富集，并在嘌呤核苷酸合成與代謝功能、癌癥通路顯著富集，示意了復方通過影響核苷酸代謝、酶活性調節的抗COVID-19作用。

凝血功能(Blood Coagulation、Response to Wounding、Wound Healing)是GO分析生物過程中的重要組成，涉及GGCX、HDAC2、PLAT、PRKACA、PRKAR2B幾種基因調控。幾項研究報告了住院COVID-19患者的心血管并發癥和靜脈血栓形成事件的發生率增加。研究發現與病毒蛋白NSP7、NSP13、E、M、N、ORF9C和ORF8直接相互作用的10種宿主蛋白參與了凝血途徑，并利用這些蛋白作為CoVex的分析起點確定了可以由GGCX編碼的維生素K依賴的γ-谷氨酰羧化酶和由PLAT編碼的組織纖溶酶原激活劑作為潛在的藥物靶點[39]?；赗NA病毒可以通過與依賴于Toll樣受體7(TLR7)的機制激活內體NADPH氧化酶的理論，研究推測與COVID-19相關的高血栓并發癥的發生率可能反映了血管內皮細胞的病毒感染，血管內皮細胞表達使SARS-CoV-2能夠侵襲細胞的ACE2蛋白。SARS-CoV-2整合入內皮細胞后，各種促炎刺激可以通過誘導組織因子(TF)的腔內內皮表達來促進血栓形成，該因子與循環凝血因子VII相互作用以觸發外源性凝血。這些刺激引起TF表達的信號傳導機制需要激活NADPH氧化酶，而不是驅動TF基因誘導轉錄的NF-кB轉錄因子的激活。將單鏈RNA病毒吸收到細胞內體后，它們會通過RNA響應的Toll樣受體7刺激內體形成和NADPH氧化酶復合物的激活。因此建議內皮細胞SARS-CoV-2感染引起TF的表達，其取決于內體NADPH氧化酶的活化。抑制內體NADPH活性的藥物可能具有減輕與COVID-19相關的血栓形成風險升高的實際潛力[40]。

在關于COVID-19重癥患者血清的蛋白質組學和代謝組學變化研究中，由于干擾素會在病毒感染期間改變尿素循環活性，由此導致了多種代謝產物的失調，COVID-19患者血清中的氨基酸及其衍生物與健康對照相比顯著降低。Cellular amino acid metabolic process(Ammonium ion metabolic process)是其中一重要生物過程。代謝組學分析表明，SARS-CoV-2感染對血清氨基酸水平有重大影響。參與SARS-CoV-2感染的另一個重要途徑是氨?；鵷RNA生物合成。該途徑在響應危險信號中起重要作用，并調節針對病毒感染的免疫力[41]。TCA循環導致富馬酸和琥珀酸的顯著調節結果，與短鏈脂肪酸上調有關的丁酸酯代謝也參與其中。

此外，Fatty acid metabolism、Fatty acid degradation是KEGG中另外的重要通路，此前已有研究表明添加花生四烯酸可抑制HCoV-229E和MERS-CoV復制[42-43]。高水平的脂肪酸可能是宿主抵抗病毒的防御機制，但同時可能引起炎癥。最近的研究發現COVID-19患者的血清顯示出?；鈮A和游離脂肪酸的水平發生了顯著變化，脂質代謝重編程在病毒復制中起著重要作用。研究結果顯示COVID-19患者甘油磷脂(PC，PE和PI)的下調和溶血磷脂(LPC和LPE)、花生四烯酸和油酸的上調[44]。GO分析顯示，protein-lipid complex subunit organization、plasma lipoprotein particle organization、regulation of plasma lipoprotein particle levels高度富集，且cellular component顯示定位集中在membrane raft、membrane region、membrane microdomain。研究驗證了血漿脂蛋白異常是SARS-CoV-2感染的多器官病理學特征。由于鞘脂與甘油磷脂是膜細胞的重要組成部分，并調節如生長調節和炎癥反應等過程，減少的磷脂會削弱感染并限制病毒的進入[45]。因此，磷脂代謝可能是針對COVID-19病毒感染的治療干預的潛在目標。

綜上所述，本研究結合構建“復方-藥物-化合物-靶點-疾病”網絡，分析篩選《溫疫論》中復方防治COVID-19的關鍵藥物和關鍵成分，通過豆甾醇、三磷酸腺苷、槲皮素、黃芩苷等活性成分，作用于34個人類靶標，并通過多途徑發揮作用，通過若干重要信號通路調控內分泌系統、免疫系統、信號轉導翻譯等生物學進程，為進一步研究《溫疫論》中復方應用及中藥防治COVID-19提供參考。