基于灰色關(guān)聯(lián)分析法探討黃精提取物抗氧化的譜效關(guān)系

趙秋華，潘喬丹，何柔柔，陸海峰，張忠偉，夏小燕

(右江民族醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣西 百色 533000)

黃精為百合科植物滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.、黃精PolygonatumsibiricumRed.或多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根莖[1]。研究發(fā)現(xiàn)，黃精藥材中主要含有多糖[2]、甾體皂苷[3]、黃酮、蒽醌類化合物、氨基酸和微量元素等多種活性成分。現(xiàn)代藥理研究表明，黃精具有抗氧化和抗衰老、改善學(xué)習(xí)記憶、降血糖、抗動脈粥樣硬化等藥理作用[4]。許多研究認為黃精多糖(PSP)是抗氧化、抗衰老的活性成分[5]，但是中藥化學(xué)成分復(fù)雜，報道難以統(tǒng)一，也有研究認為黃精總皂苷亦有抗氧化、抗自由基的作用[6]。目前的很多研究是以中藥化學(xué)成分譜和中藥藥效活性為切入點進行中藥譜效關(guān)系的研究，這樣可以更加全面地對中藥質(zhì)量進行評價，并為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供新思路[7]。灰色關(guān)聯(lián)度分析是研究事物之間、因素之間關(guān)聯(lián)度的一種統(tǒng)計學(xué)方法。關(guān)聯(lián)度定量描述了事物或因素之間關(guān)聯(lián)性的大小，關(guān)聯(lián)序反映了各指紋峰成分對藥效的“貢獻”大小順序。對數(shù)據(jù)的要求較低，能分析小樣本數(shù)據(jù)，在譜效關(guān)系研究中運用較為廣泛[8]。因此，本實驗采用不同溶劑提取黃精藥材的不同部位，建立各部位的液相圖譜，同時對不同提取部位的抗氧化活性進行評價；并采用灰色關(guān)聯(lián)分析方法計算黃精指紋圖譜特征峰(主要色譜峰)與抗氧化作用的關(guān)聯(lián)度，最終確定其主要藥效成分，為闡明黃精的抗氧化作用藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考依據(jù)，現(xiàn)將研究過程報道如下。

1 實驗材料

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀，Inertsil ODS-3色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；sartorius CPA64分析天平；HC-5002S數(shù)控型臺式超聲波清洗機；超純水機。

1.2 藥物與試劑

酒黃精藥材(廣西藍正藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號為200302)；5-羥甲基糠醛(上海源葉生物科技有限公司，批號為B21832)；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH，上海麥克林生化科技有限公司，批號為D807297)；色譜級乙腈(默克公司)；色譜級甲醇(默克公司)。其余試劑為分析純，水為超純水。

2 實驗方法

2.1 黃精提取物的制備

將酒黃精粉碎為粗粉，稱取8份，每份20 g，置錐形瓶中，分別加入160 mL不同溶劑(水、40%乙醇、60%乙醇、75%乙醇、90%乙醇、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯)，浸泡20 min，超聲提取2次，每次30 min，抽濾，合并濾液，旋干為浸膏，備用。

2.2 黃精高效液相圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 島津LC-20A高效液相色譜儀，Inertsil ODS-3色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，以乙腈和水為流動相，采用二元梯度洗脫(梯度洗脫程序見表1)，流速1 mL/min，檢測波長200 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 對照品溶液的制備 精確稱取5-羥甲基糠醛對照品適量，加甲醇溶解配制成(0.4 mg/mL)的對照品溶液，0.22 μm濾膜濾過，按照色譜條件進樣分析。

2.2.3 供試品溶液的制備 將8份黃精提取物樣品加入甲醇溶解，制成黃精提取物10 mL(相當于原藥材2 g/mL)，其中按照不同提取溶劑編號為S1(水)、S2(40%乙醇)、S3(60%乙醇)、S4(75%乙醇)、S5(90%乙醇)，S6(甲醇)、S7(正丁醇)、S8(乙酸乙酯)，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按照色譜條件進樣分析。

2.3 DPPH法測定黃精抗氧化作用

2.3.1 DPPH溶液的配制 稱取DPPH適量，加甲醇配制成100μmol/L的溶液，避光保存。

2.3.2 黃精抗DPPH氧化活性的測定 按“2.1”項下方法提取黃精提取物，加60%甲醇倍比稀釋成不同濃度供試品溶液。取供試品溶液與DPPH溶液各0.1 mL，置96孔板，混勻后室溫避光放置30 min，在517 nm處測定吸光度Ai，同時測定供試品溶液0.1 mL+60%甲醇0.1 mLAj，60%甲醇0.1 mL+DPPH溶液0.1 mLA0，6個復(fù)孔，按以下公式計算清除率：

DPPH自由基清除率=(1-(Ai-Aj)/A0)×100%

清除率(Y)對藥物濃度(X)進行對數(shù)線性回歸，根據(jù)對數(shù)函數(shù)方程求出清除率為50%時的藥物濃度。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Microsoft Office Excel 2003和SPSS AU在線統(tǒng)計分析平臺，應(yīng)用灰色關(guān)聯(lián)分析法綜合評價黃精提取物的抗氧化作用。

3 結(jié)果

3.1 HPLC色譜峰的歸屬

從8份黃精提取物(S1-S8)HPLC圖譜中確定13個共有色譜峰(圖1)。保留時間分別為：X1(7.708 min)，X2(10.125 min)，X3(15.037 min)，X4(19.839 min)，X5(20.194 min)，X6(21.055 min)，X7(21.698 min)，X8(23.524 min)，X9(29.239 min)，X10(38.116 min)，X11(47.418 min)，X12(50.804 min)，X13(68.421 min)。1號峰與5-羥甲基糠醛對照品的保留時間相同，因此鑒定為5-羥甲基糠醛。見圖2。

圖1 黃精不同溶劑提取物高效液相色譜

圖2 5-羥甲基糠醛圖譜

3.2 黃精提取物體外抗氧化作用分析

采用DPPH法測定黃精不同溶劑的抗氧化活性，結(jié)果顯示，不同溶劑提取的黃精提取物均有一定的抗氧化作用，其中75%乙醇提取的黃精提取物抗氧化作用較強，清除率為50%時藥物濃度為0.033 g/mL；正丁醇提取的黃精提取物抗氧化作用較差，清除率為50%時藥物濃度為0.108 g/mL。以不同濃度乙醇為溶劑提取的黃精提取物之間抗氧化作用差異較小，結(jié)果見表2。

表2 黃精不同溶劑提取物抗氧化作用

3.3 黃精提取物HPLC圖譜與抗氧化作用的灰色關(guān)聯(lián)分析

3.3.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 對獲得的8份黃精藥材HPLC指紋圖譜共有峰的峰面積與清除DPPH自由基活性進行灰色關(guān)聯(lián)度分析，研究兩者的相關(guān)性。將不同溶劑提取的黃精藥材清除DPPH自由基活性IC50設(shè)為參考序列(母序列)，13個共有峰峰面積設(shè)為比較序列(子序列)，將共有峰按順序編為X1-X13，原始數(shù)據(jù)進行無量鋼化處理(系統(tǒng)自動剔除2號峰數(shù)據(jù))，按照文獻方法及公式計算分析，求絕對差序列及關(guān)聯(lián)系數(shù)，關(guān)聯(lián)系數(shù)結(jié)果見表3。

表3 黃精抗氧化的譜效關(guān)系關(guān)聯(lián)系數(shù)結(jié)果

3.3.2 譜效相關(guān)性分析 對黃精不同提取溶劑HPLC指紋圖譜中各共有峰的峰面積與抗氧化活性進行灰色關(guān)聯(lián)度及關(guān)聯(lián)序分析。依據(jù)相對關(guān)聯(lián)度的大小，確定了各成分對抗氧化作用貢獻的大小順序，分析黃精抗氧化作用的譜效關(guān)系。

結(jié)果顯示，黃精抗氧化作用的藥效是多種成分共同作用的結(jié)果，各特征峰所代表的化學(xué)成分對其抗氧化藥效貢獻的大小順序，依次為：1號峰>9號峰>5號峰>8號峰>6號峰>11號峰>7號峰>4號峰>12號峰>10號峰>13號峰>3號峰，對抗氧化作用藥效貢獻大的前4 個峰分別為1、9、5、8號峰(見表4)；而1號峰經(jīng)與對照品比對，鑒定為5-羥甲基糠醛，說明5-羥甲基糠醛的關(guān)聯(lián)度最大。

表4 各色譜峰對抗氧化作用的貢獻關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果

4 討論

黃精生用刺激咽喉，經(jīng)過炮制后可消除生品黃精的刺激性及副作用，同時化學(xué)成分發(fā)生改變，產(chǎn)生了5-羥甲基糠醛(5-HMF)。5-HMF是葡萄糖焦糖化反應(yīng)和美拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物之一。現(xiàn)階段對于5-HMF探討存在著很大的爭論[9]，有報道稱該化合物對人體橫紋肌和內(nèi)臟有毒副作用[10]，但近年來其生物活性受到了人們的廣泛關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)5-HMF具有抗氧化、改善學(xué)習(xí)記憶、抗過敏、保護神經(jīng)細胞等對人體有益的作用[11]。這與本實驗中5-羥甲基糠醛與黃精抗氧化作用關(guān)聯(lián)度最大，結(jié)論一致。

建立現(xiàn)代化中藥質(zhì)量評價體系是一項系統(tǒng)工程，需要不斷革新中藥質(zhì)量評價模式，形成以中藥有效性為主體，活性物質(zhì)為基礎(chǔ)，多學(xué)科知識交互，多技術(shù)與方法共支撐的質(zhì)量評價網(wǎng)絡(luò)[12]。本實驗對黃精不同溶劑提取物進行了HPLC分析，確定了13個共有色譜峰，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法研究了共有色譜峰與抗氧化活性之間的譜效關(guān)系。發(fā)現(xiàn)各共有峰與黃精抗氧化活性均有不同程度的關(guān)聯(lián)度，關(guān)聯(lián)度在0.549～0.741之間，其中對抗氧化作用藥效貢獻大的前4 個峰分別為1、9、5、8號峰，目前已經(jīng)鑒定1號峰為5-羥甲基糠醛，這也是關(guān)聯(lián)度最大的化學(xué)成分，下一步可繼續(xù)鑒定另外的3個化學(xué)成分，對貢獻最大的4個化學(xué)成分進行定量分析及藥效評價等研究，以期進一步明確黃精抗氧化作用的活性成分，為闡明黃精抗氧化作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。