馬鈴薯中烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的殘留檢測(cè)與儲(chǔ)藏穩(wěn)定性研究

趙子丹，吳 燕，劉 霞，張鋒鋒，陳 翔，張 艷

（寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，寧夏 銀川 750002）

馬鈴薯生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)，兼具食用、加工、飼料等多種功能，目前已成為世界第四大糧食作物[1]，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有非常重要的地位。隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的提出，伴隨種植規(guī)模化的大力推進(jìn)，病蟲(chóng)害已成為嚴(yán)重制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素之一[2]。晚疫病是馬鈴薯的主要病害之一，每年可造成我國(guó)馬鈴薯減產(chǎn)約10%～15%[3]。目前，施用高效低毒的化學(xué)農(nóng)藥仍是有效防治該病害的主要方式。烯酰嗎啉（Dimethomorph）是通過(guò)抑制卵菌細(xì)胞壁的形成而殺滅病菌的內(nèi)吸性殺菌劑[4]，對(duì)霜霉目真菌類疫病有較好的防治效果[5-8]。氟吡菌胺（Fluopicolide）是一種具有內(nèi)吸傳導(dǎo)活性的新型低毒殺菌劑，通過(guò)作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞間的特異性蛋白而殺滅病原菌[9]。氟吡菌胺的殘留物定義為氟吡菌胺及其代謝物2,6-二氯苯甲酰胺（BAM）。因此，在檢測(cè)氟吡菌胺時(shí)應(yīng)同時(shí)檢測(cè)BAM的殘留。有研究表明，氟吡菌胺對(duì)葡萄[10-11]、馬鈴薯[12]、番茄[13]、黃瓜[14]、葉用萵苣[15]、節(jié)瓜[16]等多種作物的霜霉病、晚疫病等均具有良好的防治效果。

當(dāng)前，針對(duì)馬鈴薯晚疫病防治的最有效措施是噴施復(fù)合殺菌劑[17-18]，既可降低抗性產(chǎn)生的概率，又能提高殺菌效果。關(guān)于單獨(dú)噴施烯酰嗎啉或氟吡菌胺防治馬鈴薯晚疫病的殘留檢測(cè)已有報(bào)道[19-20]。但烯酰嗎啉和氟吡菌胺的復(fù)合殺菌劑在馬鈴薯中使用后的殘留及代謝物檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合QuEChERS處理方法，建立了馬鈴薯中烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的殘留量分析方法，該方法的前處理簡(jiǎn)便、分析快速準(zhǔn)確，可為馬鈴薯中烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的檢測(cè)分析提供技術(shù)支撐。

通常在農(nóng)藥殘留檢測(cè)的過(guò)程中，含有殘留的樣品會(huì)在冷凍條件下儲(chǔ)藏一段時(shí)間，在此過(guò)程中農(nóng)藥殘留物可能會(huì)因?yàn)閾]發(fā)或與酶等發(fā)生反應(yīng)而有所損失或變化。因此，需要進(jìn)行農(nóng)藥在該基質(zhì)中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性研究。故同時(shí)進(jìn)行了烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在馬鈴薯中儲(chǔ)藏期間的穩(wěn)定性試驗(yàn)，以期為烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在馬鈴薯中的穩(wěn)定性研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

馬鈴薯樣品，采自寧夏農(nóng)林科學(xué)院園林場(chǎng)試驗(yàn)基地，品種為克新1號(hào)。

烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品（98.78%）、氟吡菌胺標(biāo)準(zhǔn)品（98.78%）、BAM標(biāo)準(zhǔn)品（99.43%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；36%氟吡菌胺·烯酰嗎啉懸浮劑（農(nóng)藥制劑中有效成分含量為：氟吡菌胺6%，烯酰嗎啉30%），江陰蘇利化學(xué)股份有限公司。乙腈、甲醇（色譜純），默克股份兩合公司；氯化鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（GCB），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

AB SCIEX QTRAP 5500超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；PL202-L型電子天平、XS205型電子天平，瑞士Mettler Toledo儀器有限公司；MJ-PB12Power304破壁料理機(jī)，廣東美的生活電器制造有限公司；THZ-92C恒溫振蕩器，上海喬躍電子有限公司；TDL-40C低速臺(tái)式大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；MS3 digital型渦旋混合器，德國(guó)IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM標(biāo)準(zhǔn)品分別用乙腈溶解并定容，配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再分別用乙腈稀釋配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃冰箱中保存?zhèn)溆谩悠贩治鰰r(shí)，再分別用馬鈴薯空白基質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品的提取與凈化

準(zhǔn)確稱取勻漿的馬鈴薯樣品10.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，振蕩提取30 min，加入4 g氯化鈉充分振搖1 min后，4 000 r/min離心5 min。吸取上清液2.0 mL，經(jīng)50 mg PSA和50 mg C18的混合凈化劑凈化后，渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min。上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.3 液相色譜條件

Waters Acquity BEHC18（2.1 mm×100 mm，1.7μm）色譜柱；柱溫40℃；進(jìn)樣量2μL；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液；流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～3 min，流動(dòng)相A 10%～90%，保持0.6 min；3.6～4.0 min，流動(dòng)相A 90%～10%，保持2 min。

1.2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，電離方式：ESI+；離子源溫度：500℃；離子化電壓：5 500 V；噴霧氣流速：50 L/h；氣簾氣流速：50 L/h；碰撞氣流速：約200～600 L/h；定量方式：外標(biāo)法；掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。

1.2.5 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取馬鈴薯空白樣品10.00 g于50 mL離心管中，按照0.50 mg/kg的添加水平直接在儲(chǔ)藏穩(wěn)定試驗(yàn)所需的空白樣品中分別單獨(dú)添加烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM標(biāo)準(zhǔn)溶液，將所有離心管進(jìn)行密封，放入低于-18℃冰箱中保存。將樣品制備當(dāng)天、2周、1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月作為取樣時(shí)間點(diǎn)，每次取穩(wěn)定性試驗(yàn)樣品2個(gè)進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)測(cè)定空白樣品1個(gè)，質(zhì)控樣品3個(gè)。其中質(zhì)控樣品為取樣當(dāng)天對(duì)空白樣本分別進(jìn)行烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM標(biāo)準(zhǔn)溶液的添加。定期取樣，按照建立的檢測(cè)方法測(cè)定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用MultiQuantTM軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別配制1 mg/L的烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)針泵進(jìn)樣，在電噴霧電離ESI（+/-）方式下進(jìn)行全掃描（m/z 50～450）。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物均在正離子掃描時(shí)出現(xiàn)較強(qiáng)的分子離子峰[M+H]+。因此，本研究選擇正離子掃描方式，以[M+H]+為化合物的母離子碎片峰，分別確定母離子后再依次優(yōu)化子離子。選擇信噪比高、峰形好、干擾小的離子對(duì)作為定性定量離子對(duì)，以多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式分別優(yōu)化目標(biāo)化合物的碰撞能量和去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)，最終經(jīng)過(guò)優(yōu)化后獲得的質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

表1 目標(biāo)化合物的液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）參數(shù)Table 1 LC-MS/MS parameters of target pesticide

采用上述確定的色譜條件和質(zhì)譜條件對(duì)0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，得到烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖，見(jiàn)圖1。

圖1 烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖Fig.1 Standard solution total ion chromatogram of dimethomorph,fluopicolide and its metabolites

2.2 凈化劑的選擇

通過(guò)對(duì)PSA、C18和GCB 3種凈化劑的使用方式和用量?jī)?yōu)化馬鈴薯中目標(biāo)物凈化回收效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，GCB對(duì)烯酰嗎啉有吸附作用，因此確定選擇PSA和C18為凈化劑。通過(guò)對(duì)PSA和C18的用量進(jìn)行不同配比優(yōu)化，得到50 mg PSA和50 mg C18的組合凈化效果最佳。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

為了消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，使用馬鈴薯空白樣品提取液，配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。將10 mg/L的烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋配制成濃度為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測(cè)定。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x），響應(yīng)峰峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2可知，烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在0.01～0.50 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r值均大于0.999。以稱樣量為10 g，定容體積為20 mL計(jì)，通過(guò)3倍信噪比計(jì)算檢出限（LOD），烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的檢出限均為0.002 mg/kg。

表2 烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的線性方程、r值及檢出限Table 2 Linear regression equations,correlation coef cients(r)and LOD of dimethomorph,fluopicolide and its metabolites BAM

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

在馬鈴薯空白樣品中分別添加濃度為0.01、0.10、0.50 mg/kg的烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度重復(fù)5次，按照上述方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。由表3可知，在0.01～0.50 mg/kg添加水平范圍內(nèi)，烯酰嗎啉在馬鈴薯中平均添加回收率為90%～96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.6%～5.5%；氟吡菌胺在馬鈴薯中的平均添加回收率為94%～96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～3.2%；BAM在馬鈴薯中的平均添加回收率為93%～96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～2.7%。上述結(jié)果表明，方法的準(zhǔn)確度和精密度均能夠滿足農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則的要求（NY/T 788—2018[21]），且目標(biāo)峰無(wú)雜質(zhì)干擾。

表3 烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在馬鈴薯中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of dimethomorph,fluopicolide and its metabolites BAM in potato(n=5)

2.5 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表4可知，在低于-18℃條件下儲(chǔ)藏6個(gè)月的試驗(yàn)期間，馬鈴薯基質(zhì)中烯酰嗎啉的平均降解率為7%～19%，質(zhì)控結(jié)果為92%～97%；氟吡菌胺的降解率為0～16%，質(zhì)控結(jié)果為92%～100%；BAM的降解率為0～13%，質(zhì)控結(jié)果為93%～101%，其中質(zhì)控樣品檢測(cè)結(jié)果以平均回收率表示，結(jié)果符合農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則的要求。根據(jù)NY/T 3094—2017[22]的規(guī)定，每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的儲(chǔ)藏試驗(yàn)樣品中烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的降解率均小于30%，表明在儲(chǔ)藏溫度低于-18℃、儲(chǔ)藏時(shí)間為6個(gè)月的試驗(yàn)期間，烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在馬鈴薯基質(zhì)中均比較穩(wěn)定。

表4 烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在馬鈴薯中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性結(jié)果Table 4 Storage stability results of dimethomorph,fluopicolide and its metabolites in potatoes 單位：%

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以乙腈為提取試劑，建立了馬鈴薯中烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM檢測(cè)的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。方法采用QuEChERS前處理，乙腈用量少，分析時(shí)間短，節(jié)約了試驗(yàn)成本，提高了試驗(yàn)效率，可為其他農(nóng)產(chǎn)品及食品中烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的殘留檢測(cè)提供參考依據(jù)。烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在0.01～0.50 mg/kg濃度范圍內(nèi)的平均添加回收率為90%～96%，表明方法的準(zhǔn)確度高，精密度好，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析要求。儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，儲(chǔ)藏溫度低于-18℃、儲(chǔ)藏時(shí)間為6個(gè)月的試驗(yàn)期間，烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在馬鈴薯中均比較穩(wěn)定。