遼寧省玉米品種種質SSR分子多樣性分析

朱志成

(遼寧省農業發展服務中心省種業發展中心,遼寧 沈陽 110034)

玉米是遼寧省第1大作物，優質玉米品種是實現玉米產業優質高效的重要基礎，也是產前技術的核心，種質基礎是選育玉米新品種的根基，正確分析與評價遼寧省品種種質基礎，為創新和突破現有的育種水平提供依據[1]。本文研究玉米品種SSR分子聚類分析，以期使分子標記輔助育種得到實際應用。因此，利用SSR分子技術對玉米品種種質進行聚類分析，對雜種優勢群的劃分、種質創新及新品種的選育等具有指導意義[2]。

玉米品種的分子鑒定技術經過十多年的系統研究和鑒定實踐，從RAPD標記技術，到目前基于SSR標記技術日趨成熟。SSR標記技術相比RFLP、RAPD和AFLP等標記，具有多態性高、共顯性遺傳和操作簡單等優點[3]，應用在禾谷類、豆類、薯類和蔬菜類等作物的遺傳圖譜構建、品種鑒定、基因定位和分子輔助育種等領域。國內外學者以玉米品種為實驗材料，通過20～70個SSR引物進行擴增，檢測到上百個等位基因變異位點，表明具有豐富的多態性信息，可以進行種質資源鑒定、雜種優勢群劃分、QTL定位和分子輔助育種等研究[4]。

本研究利用SSR分子技術對目前遼寧省主要推廣的20個玉米品種進行分子鑒定，為更好地利用遼寧省優質玉米品種種質，以及分子標記輔助育種提供遺傳信息奠定基礎。

1 材料

供試材料為20種不同玉米品種，由遼寧省種子管理局提供。品種名稱見表1。

表1 供試玉米品種名稱

2 方法

2.1 玉米品種基因組DNA提取

采用CTAB法提取玉米種子DNA[5]。

2.2 玉米品種SSR引物合成

根據國內外有關文獻，考慮引物多態性，并評價其在均勻地分布在染色體上，篩選20對SSR核心引物[5]，見表2，由大連TaKaRa生物工程公司合成。

2.3 玉米品種PCR擴增

PCR反應終濃度組成為1×PCR Buffer，Mg2+2.5mmol·L-1，dNTPs 0.15mmol·L-1，雙向向引物0.25μmol·L-1，Taq DNA聚合酶1.0U，DNA模板2μL，總體積達到20μL。

反應程序：94℃時預變性5min，94℃時變性40s，60℃時退火35s，72℃時延伸45s，循環擴增35次，72℃時延伸5min，4℃時保存待測。

表2 20對SSR核心引物

2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離電泳

PCR擴增產物在94℃變性5min后，用4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。預電泳恒功率為90W，時間為20min；電泳分離恒功率為80W，時間為40min。用10%冰醋酸，固定時間為5min，用0.2%AgNO3溶液，染色時間為5min；雙蒸水漂洗凝膠2次，每次時間10s；用1.5% NaOH、0.4%甲醛配制顯影液，顯影；10%冰醋酸對凝膠定影。

2.5 數據處理

將不同玉米品種在同一引物擴增的所有DNA譜帶統一排序，按照擴增片段從小到大順序，在相同遷移位置有譜帶的記錄“1”，沒有譜帶的記錄“0”，缺失記錄“9”，聚類分析0-1數據系統，距離系數為Nei,Lix系數，Cs=1-2a/(2a+b+c)按UPGMA方法進行聚類。所有的數據處理均采用Microsoft Excel 2013和Microsoft Word 2013，對玉米品種SSR分子鑒定結果進行聚類分析采用DPS 7.05。

3 結果

3.1 玉米品種的SSR分子鑒定結果

如圖1所示，PCR產物在電泳分離顯影后，DNA擴增條帶清晰可辨，具有良多態性，可以將結果記錄統計。將引物擴增的所有DNA譜帶統一排序，按照擴增片段從小到大順序，有譜帶的記錄“1”，沒有譜帶的記錄“0”，缺失記錄“9”,形成統計表用于聚類分析。

SSR分子技術分析中選取20對引物，在供試材料中共檢測到118譜帶，即118等位基因變異，選取清晰可辨的多態性片段83條用于數據統計。

3.2 玉米品種SSR聚類分析結果

圖1 不同SSR引物擴增玉米的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜

本研究20對SSR核心引物中，電泳譜帶清晰且穩定，平均分布在每一條染色體上，滿足玉米品種SSR分析。共檢測出83個等位基因。從圖2可知，各品種間遺傳距離系數為0.13～0.79，選取0.57為閾值，20個品種依據閥值可以劃分為4個類群，其中品種“乾坤1101”、“金剛98”、“鄭單958”、“連科8號”、“遼禾308”、“丹玉336號”、“乾坤528”等7個供試樣品劃為第Ⅰ類群；品種“東單60”劃為第Ⅱ類群；品種“錦成九”、“鐵南2號”、“鐵研818”、“郁青1號”、“遼單452”、“致泰6號”、“千松101號”、“佳昌689”、“鐵旭1843”、“郁青123號”等10個供試樣品劃為第Ⅲ類群；品種“元鈺66”、“富友1號”等2個供試樣品劃為第Ⅳ類群。

圖2 玉米品種SSR鑒定聚類樹狀圖

通過雜種優勢模式的分析，可知旅黃改系統的品種全部劃分在第Ⅰ類群中，群內品種之間的遺傳距離為0.14～0.66；“東單60”單獨成1個群，為旅大紅骨系統，同第Ⅰ類群親緣關系較近；第Ⅲ類群的群內品種絕大部分是瑞德系統改良的品種，品種之間的遺傳距離為0.18～0.64；品種“元鈺66”、“富友1號”等2個供試樣品獨立成群，與其它品種親緣關系較遠。結果表明，遼寧主栽玉米品種中，旅黃改系統的應用有明顯增加的幅度，同時，瑞德系統改良的品種也有上升趨勢，說明遼寧玉米品種種質具有一定的遺傳多樣性。

4 討論

遼寧省位于東北平原，其地貌類型復雜多樣。東南部以山地丘陵沿海為主，中北部以平原內陸為主，由于地勢和環境等因素，當地延續下來品種經過長期的實踐選擇，具有一定的品種種質多樣性。同時，本研究選取的品種數量有一定的局限性，若增加供試品種數量，聚類分析劃分的類群會更細致些。

本文選取20對SSR引物進行研究，對其結果聚類分析，通過品種間的血緣關系遠近，劃分不同的類群。對試驗進一步增加所選SSR引物，也可增加類群數量，但劃分類群過細，也不利用類群內挑選適當遺傳距離的目標株系。通過下一步與配合力測定及評價相結合，拓寬遼寧省的玉米遺傳基礎提供物質基礎和理論參考，為更好地利用遼寧省優質玉米品種種質，以及分子標記輔助育種提供遺傳信息奠定基礎。