水分活度對貯藏脫水香蔥的風味和菌群的影響

謝旻皓，浦浩亮，蘇安祥，胡秋輝，楊文建*

（南京財經大學食品科學與工程學院，現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇 南京 210023）

香蔥（Allium schoenoprasum）是一種廣受歡迎的百合科類蔬菜和調味品，具有味清香微辣、可去腥調味等風味特點以及抗氧化、抑菌和抗炎等生物活性[1-2]。新鮮香蔥含水量高，容易腐敗變質；脫水干制后香蔥貨架期延長，并且具有易儲存、體積小、運輸及食用方便等優點，因此脫水干制品也是香蔥重要的消費形式[3-4]。目前關于脫水香蔥的研究主要集中在干制工藝和品質保持等方面，主要加工方式包括熱風干燥、冷凍干燥、紅外干燥、聯合干燥等[4-6]，但脫水香蔥在貯藏過程中的品質劣變和安全控制還較少研究。

在貯藏過程中，脫水蔬菜常常發生因受潮吸水而導致的嚴重品質劣變和微生物生長等問題，從而大大降低了其商品價值。環境水分活度（water activity，aw）對果蔬干制品的品質穩定性至關重要[7]。脫水蔬菜在貯藏期間水分含量及水分流動性持續增加，從而影響香蔥等脫水蔬菜的化學穩定性和微生物多樣性和組成[2,8-9]。微生物生長和增殖與aw密切相關，相關研究報道了多種食品體系中aw對微生物生長以及群落組成的影響[10-12]。Martins等研究表明，aw越高，葡萄皮表面的微生物代謝活性越強，多樣性越豐富，可培養的微生物種群也越多[13]。微生物的生長會消耗基質營養物質并產生多種代謝產物，由此引起食品品質和風味的劣變，從而影響其市場價值。貯藏期間的aw也會顯著影響脫水食品的風味特征。高aw貯藏條件能夠導致脫水胡蘿卜、脫水香菇等食品特征性風味成分的丟失和風味品質的下降[8,14]，貯藏期間的水分遷移也會誘導海參多肽干粉異味揮發性成分的產生[15]。

本課題組前期研究了脫水香蔥在不同aw貯藏條件下的外觀、水分含量以及分布、微觀結構、槲皮素含量等品質變化規律，結果表明脫水香蔥在高aw貯藏條件下結合水含量和流動性增加，色澤和硬度下降，微觀結構坍塌，槲皮素降解加劇，并且風味成分變化顯著[2]。本實驗通過分析不同aw貯藏條件下脫水香蔥的細菌多樣性與菌群變化，通過氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）測定揮發性成分的相對含量，闡釋aw貯藏條件對細菌菌群和揮發性成分的影響，并分析揮發性成分與細菌組成之間的關系，探討不同aw環境下脫水香蔥的品質劣變規律和原因，為脫水香蔥在貯藏過程中的品質保持和貨架期延長提供進一步的理論參考和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熱風干燥脫水香蔥購自江蘇興化脫水食品集團有限公司。

C7～C33正構烷烴、二硫基丙醇 美國Sigma-Aldrich公司；TIANamp細菌DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；其他常用化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

GNP9160型隔水式恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；7890A-5975C GC-MS儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理與貯藏實驗

采用Hatzidimitriou等的方法[16]，配制K2CO3、NaNO2、NaCl和KCl飽和溶液各1 000 mL，分別置于直徑30 cm干燥器中，用凡士林密封并在25 ℃恒溫恒濕箱中平衡2 d，形成aw別為0.43、0.67、0.78和0.84的密閉環境。挑選大小均一、顏色鮮艷的新制備熱風干燥脫水香蔥200 g放入培養皿中，并放置于干燥器內，不同aw環境設置10 個平行，取貯藏0 d和50 d的樣品觀察并進行各項指標的測定。

1.3.2 脫水香蔥的細菌群落分析

脫水香蔥總菌液參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[17]方法獲得，按照TIANamp細菌DNA提取試劑盒說明書的步驟提取總菌液DNA。將提取的DNA樣品密封，干冰氛圍下送至上海天昊遺傳分析中心，采用Illumina Miseq平臺和進行高通量擴增子測序分析。測序區域為細菌16S rDNA V3～V4區，引物序列為341F：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’和805R：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’。每組樣品取3 個重復，細菌DNA測序數據經FLASH軟件拼接和Usearch過濾非特異性擴增片段，得到有效序列。有效序列由UPARSE軟件（v7.0.1001）按97%相似度聚類得到可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）[18]。使用Mothur軟件，參照Ribosomal database project（RDP）數據庫，注釋OTUs表示的物種信息，并統計樣品在生物分類學各分類水平下的物種組成和相對豐度[19]。使用R軟件包vegan統計各樣品的微生物群落的多樣性（Shannon指數和Simpson指數），采用主成分分析（principal components analysis，PCA）、非度量多維尺分析（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）和基于Bray-Curtis距離的聚類分析判別細菌群落的組間相似性。

1.3.3 揮發性成分的測定

采用頂空-固相微萃取法（hand space solid-phase microextraction，HS-SPME）萃取不同貯藏條件下脫水香蔥的揮發性成分[8,20]。稱取1.0 g樣品研磨后置于20 mL頂空固相萃取瓶，并加入10 μL內標溶液（二硫基丙醇，0.1 μg/mL），用聚四氟乙烯蓋密封，于60 ℃恒溫水浴平衡10 min，將老化后的三涂層DVB/CAR/PDMS固相萃取頭插入頂空瓶中，固相萃取40 min左右。通過GC-MS對脫水香蔥的揮發性成分分離鑒定，將萃取頭插入GC-MS進樣口中，在250 ℃解析30 min。解析后化合物通過DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）進行分離。

GC條件：初始溫度45 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至130 ℃，再以8 ℃/min升溫至200 ℃，最后以12 ℃/min升溫至250 ℃，保持7 min；載氣He；流速0.8 mL/min；分流比1∶1。MS條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；質量掃描范圍45～450 u。

將GC-MS分析的質譜數據通過計算機檢索與Wiley質譜數據庫、NIST/EPA/NIH質譜數據庫和NIST 08質譜數據庫比較，分析匹配度高于90%的揮發性物質[21]。利用正構烷烴的保留時間計算揮發性化合物的保留指數[22]。

1.4 數據統計與分析

數據結果以平均值±標準差表示。采用SPSS軟件對實驗數據進行統計分析，以單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）檢驗顯著性，P＜0.05表示差異顯著。采用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）和LDA差異貢獻分析（LDA effect size，LEfSe）檢驗微生物物種豐度的組間差異，LDA＞2表示差異顯著[23]。使用Simca 14.1軟件的正交偏最小二乘法（orthogonal partial least squares，OPLS）分析可揮發性成分與細菌之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 不同aw環境下脫水香蔥的細菌多樣性

在不同aw環境下貯藏50 d后，脫水香蔥樣品表現出不同的外觀品質。高aw條件（0.78和0.84）下貯藏的香蔥樣品發生非常明顯的褐變和微生物增殖的情況，已經失去了實際利用價值，而低aw貯藏條件（0.43）下的脫水香蔥樣品變化較小。進一步采用高通量測序技術研究不同aw環境下脫水香蔥的細菌群落組成的差異。隨著測序深度的增加，各脫水香蔥樣品中檢測到的細菌OTUs數量增加并逐步趨于平穩（圖1A），Shannon指數也達到穩定（圖1B），表明測序深度已經幾乎覆蓋脫水香蔥樣品中的所有細菌物種，測序數據可信。Shannon和Simpson多樣性指數分析結果表明，貯藏前的脫水香蔥樣品細菌多樣性最低，貯藏50 d后，脫水香蔥的細菌多樣性相比貯藏前顯著升高，但是不同aw條件下香蔥的細菌多樣性之間沒有顯著性差異（圖1C、D）。

圖1 不同aw貯藏條件下脫水香蔥樣品細菌的稀釋曲線（A）、Shannon曲線（B）、Shannon指數（C）和Simpson指數（D）Fig.1 Rarefaction curves (A), Shannon curves (B), Shannon indexes (C)and Simpson indexes (D) of the microbiota in chive samples stored at different aw conditions

2.2 不同aw環境下脫水香蔥細菌組成的相似性

所有脫水香蔥樣品含有的細菌的DNA一共被歸為1 714 個OTUs，其中所有樣品共有的OTUs 137 個，有4 個和257、121、274、158 個OTUs分別僅出現在貯藏0 d和aw為0.43、0.67、0.78和0.84下的脫水香蔥樣品中（圖2A）。PCA、NMDS和聚類分析結果表明，在不同aw條件下貯藏50 d之后，脫水香蔥樣品的細菌群落結構與貯藏前的樣品顯著不同（圖2B～D）。值得注意的是，在NMDS分析中，隨著貯藏環境aw的增加，貯藏50 d后的脫水香蔥的細菌群落結構在MDS1軸上距離貯藏前的樣品的距離越來越遠。這些結果表明，貯藏環境的aw對貯藏脫水香蔥的細菌群落有顯著影響。

圖2 不同aw貯藏條件下脫水香蔥樣品細菌的相似性Fig.2 Similarity in the microbiota in chive samples stored at different aw conditions

2.3 不同aw環境對脫水香蔥細菌菌落組成的影響

如圖3A、D所示，在貯藏前，脫水香蔥樣品含有的細菌以Proteobacteria和Firmicutes為主，其他門的細菌很少；在不同aw條件貯藏50 d后，Firmicutes的相對豐度下降，出現大量Actinobacteria以及Bacteroidetes等其他門的細菌，并且高aw條件（0.78和0.84）下的脫水香蔥樣品Actinobacteria相對豐度高于低aw條件（0.43和0.67）下貯藏的香蔥樣品。如圖3B、D所示，在科水平上，相比貯藏前樣品（0 d），在不同aw條件貯藏50 d，所有樣品的Leuconostocaceae和Enterobacteriaceae相對豐度都顯著降低（LDA＞2）；貯藏在最高aw條件（0.84）下的脫水香蔥樣品中，Micrococcaceae、Microbacteriaceae、Sphingomonadaceae、Nocardiaceae、Propionibacteriaceae、Burkholderiaceae等17 個科的相對豐度顯著高于其他所有組（LDA＞2）。如圖3C、D所示，在屬水平上，不同aw條件貯藏50 d后的所有香蔥樣品中的Weissella、Erwinia、Rosenbergiella、Ewingella的相對豐度顯著降低（LDA＞2）；在aw0.84條件下貯藏的樣品有Kocuria、Rhodococcus、Microbacterium、Streptococcus、Propionibacterium、Clostridium_sensu_stricto、Bacillus等20 個屬的相對豐度高于其他組（LDA＞2）。本課題組前期實驗觀察到，Leuconostocaceae、Enterobacteriaceae、Weissella、Ewingella等也是未經貯藏的脫水香菇樣品中的優勢菌種群，貯藏50 d后脫水香菇的Weissella、Lactococcus等菌的相對豐度下降，Kocuria、Bacillus等的相對豐度隨著aw增加而上升[9]。Park等研究了Saeng-sik（一種含有谷物、水果、蘑菇、海藻等原料的干燥粉狀即食食品）中的細菌組成，發現隨著的aw增加，Bacillus相對豐度顯著上升[24]，與本實驗結果趨勢一致。Streptococcus等乳酸菌可能引起食品腐敗變質并產生異味化合物[25]。Kocuria、Rhodococcus、Microbacterium、Streptococcus、Propionibacterium、Bacillus等都是革蘭氏陽性菌，它們相較于革蘭氏陰性菌對干燥和機械處理的耐受程度更高，更容易在脫水和加工過程中存活[26]。Weissella可產生細菌素等物質，能抑制食源性病原菌和腐敗微生物的生長[27]，其相對豐度降低可能為其他微生物生長提供條件。

圖3 不同aw貯藏條件下脫水香蔥樣品細菌的群落組成Fig.3 Microbial community composition in chive samples stored at different aw conditions

2.4 不同aw環境對脫水香蔥揮發性成分的影響

表1列出了貯藏前和在不同的aw條件下貯藏50 d脫水香蔥中的揮發性化合物的相對含量。將鑒定出的32 種揮發性化合物，根據風味物質的化合物類別，歸為烴類、酮類、硫化物類、醇類和醛類、酯類和其他（雜環和芳香族化合物）6大類，包括烴類15 種、酮類5 種、硫化物3 種、酯類3 種、醇類和醛類2 種，其他4 種。對于貯藏前的樣品，共檢測出20 種揮發性物質，其中硫化物是主要揮發性風味化合物，包括二甲基三硫、2,5-二甲基噻吩、甲基丙基二硫醚，其相對含量分別為4.22%，13.77%和2.63%；另外，2,3-二甲基吡啶相對含量最高，達25.86%。劉源[28]、田震[29]等采用SPME-GC-MS檢測了新鮮香蔥的揮發性成分，表明含硫化合物是主要的揮發性成分，包括甲基丙基二硫醚、三甲基二硫醚、二丙基二硫醚、二丙基三硫醚等。田震等還發現烴類化合物是香蔥干制品中主要揮發性成分，并且干燥方式會顯著影響香蔥揮發性化合物的種類和含量[29]。經過50 d貯藏之后，硫化物的種類和相對含量均出現下降的現象。當貯藏在aw高于0.67的環境下，脫水香蔥失去了典型的揮發性物質二甲基三硫和甲基丙基二硫醚。硫化物的相對含量也從0 d樣品的20.62%最低下降到3.38%（aw0.78）。在硫化物損失的同時，貯藏50 d之后烴類的種類和相對含量增加，尤其是4-異丙基甲苯，在aw0.78和0.84條件下的相對含量均超過了30%；萜品油烯相對含量隨著aw的升高而增加，從貯藏前的2.27%達到12.57%（aw0.84）。硫化物種類和相對含量減少和烷烴類種類和相對含量的增加，表明貯藏條件的高aw會引起特征風味物質損失。在本課題組之前的研究中也發現了類似的結論，高aw貯藏條件能夠加劇脫水胡蘿卜、香菇等脫水果蔬食品的特征性風味成分的丟失和風味品質的下降[8,14]。

表1 不同aw環境下脫水香蔥揮發性成分含量的變化Table 1 Changes in the contents of volatile compounds in dried chives stored at different aw conditions

續表1

2.5 揮發性成分與細菌之間的相關性

脫水香蔥的揮發性成分的變化可能是由微生物代謝引起的，細菌會產生一系列揮發性有機化合物，從而影響食物的風味。為探明脫水香蔥貯藏前及在不同aw條件下貯藏50 d的細菌群落和揮發性化合物相對含量的相關性，采用OPLS模型建立脫水香蔥樣品中揮發性化合物的相對含量與細菌種屬相對豐度之間的相關性。OPLS模型的R2Y和Q2分別為0.659和0.605，表明OPLS方法適合于該實驗的分析和預測。根據揮發性化合物和屬水平上細菌之間的相關系數可知，36 種細菌和30 種揮發性化合物相關（|ρ|＞0.70）。揮發性化合物與細菌的關系如圖4所示，可以看出Kocuria、Streptococcus、Nocardioides、Ewingella、Rosenbergiella、Dietzia、Erwinia、Microbacterium、Bacillus等菌的相對豐度與多種揮發性成分的生成和相對含量降低關系密切，可能對脫水香蔥的貯藏特性和產品品質具有重要影響。脫水香蔥在貯藏過程中的氣味變化可能來源于揮發性化合物前體的轉化，也可能是微生物的生長和代謝產生的揮發性有機成分影響了食品的風味[30-31]。

圖4 脫水香蔥揮發性成分和細菌組成的相關性Fig.4 Correlation between volatile compounds and microbial communities in dried chives

3 結 論

本實驗研究了脫水香蔥在不同aw條件下貯藏50 d后的揮發性成分和細菌群落組成，并探討兩者之間的相關性。實驗結果表明，在不同aw條件下貯藏50 d后，脫水香蔥的細菌多樣性顯著升高，但是不同aw條件下香蔥的細菌多樣性之間沒有顯著性差異；脫水香蔥樣品的細菌群落結構與貯藏前的樣品顯著不同，并且貯藏環境的aw對貯藏脫水香蔥的細菌群落有顯著影響。貯藏50 d后，脫水香蔥樣品的Firmicutes門，Leuconostocaceae和Enterobacteriaceae科，Weissella、Erwinia、Rosenbergiella和Ewingella屬的相對豐度顯著降低；貯藏在最高aw（0.84）下的脫水香蔥樣品中的Micrococcaceae、Microbacteriaceae、Nocardiaceae等17 個科和Kocuria、Streptococcus、Bacillus等20 個屬的相對豐度顯著高于其他組。貯藏50 d之后，脫水香蔥揮發性成分中的硫化物的種類和相對含量下降，烴類的種類和相對含量增加。另外，Kocuria、Streptococcus、Bacillus等菌的相對豐度與多種揮發性成分的生成和相對含量降低關系密切。本研究揭示了aw對脫水香蔥的貯藏特性和產品品質的重要影響，可為脫水香蔥在貯藏過程中的品質保持和貨架期延長提供進一步理論參考和技術支撐。