南極磷蝦油對硫酸葡聚糖鈉鹽誘導潰瘍性結腸炎小鼠的抗氧化作用機制

周曉玲，相興偉*，周宇芳，鄭 斌，鄧尚貴，廖妙飛，聞正順

（1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山 316021；3.浙江工業(yè)大學食品科學與工程學院，浙江 杭州 310014）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性、易復發(fā)且非特異性的炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD），病變區(qū)域主要發(fā)生在結腸至直腸的黏膜及黏膜下層[1]。UC患者主要病癥包括體質量減輕、食欲下降、頻繁腹痛腹瀉、便血等狀況[2]。每年全球UC的發(fā)病率和患病率不斷上升，逐漸成為一項公共健康衛(wèi)生問題，嚴重影響患者的生活[3]。目前，對于UC的發(fā)病機制尚存在爭議，無法準確定義。

研究表明降低機體過度氧化應激對UC病理治療具有重要意義[4]。正常狀態(tài)下的機體可通過氧化/抗氧化系統(tǒng)維持體內代謝過程中自由基生產(chǎn)與消除的動態(tài)平衡。腸道在機體消化吸收過程中可接觸到多種致氧化因子，如鐵離子、銅離子、血紅素、醛等，易造成氧化損傷[5]。隨著腸道炎癥程度加深和抗氧化系統(tǒng)被破壞，過度氧化應激刺激有害氧自由基分子和過氧化物的合成釋放，導致腸道功能屏障保護系統(tǒng)損傷加劇[6]。

南極磷蝦（Euphausia superba）是南極海域的小型浮游生物，其因龐大的生物量和高營養(yǎng)價值而備受關注[7]。南極磷蝦油（Antarctic krill oil，AKO）是南極磷蝦資源開發(fā)利用的重要產(chǎn)品，由多種生物活性成分組成[8]。AKO可作為攝入n-3系多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）的良好來源，其中30%～65%的n-3 PUFAs以與磷脂結合的形式存在，這有利于穿透腸壁進行吸收[9]。此外，AKO還含有高濃度的蝦青素以及VA、VE等天然抗氧化成分，具有抗氧化特性[10]。研究證明AKO對人體無害、耐受性好、易被人體吸收[11]。近些年研究表明AKO還具有減輕心血管疾病[12]，調節(jié)高脂血癥[13]，預防和改善神經(jīng)認知功能障礙[14]、抑郁[15]等多種功能，并可改善疾病過程中伴隨著的持續(xù)性氧化應激狀態(tài)。Grimstad等報道AKO可改善UC大鼠炎癥狀態(tài)和減少血液中氧化標記物水平，但對具體的抗氧化機制未進行深入研究[16]。因此，本實驗探討了AKO對硫酸葡聚糖鈉鹽（dextran sulfate sodium，DSS）誘導實驗性UC小鼠中的抗氧化機制，為AKO的開發(fā)和利用提供一些理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

5 周齡清潔級健康雄性BALB/c小鼠（體質量（15±1）g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-006）購自浙江醫(yī)學科學院。小鼠普通鼠糧及玉米芯墊料購自蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司。

AKO由浙江省海洋開發(fā)研究院提取制備，4 ℃保存。AKO含約48.4%（質量分數(shù)，下同）磷脂、37.9%甘油三酯、13.9%游離脂肪酸、0.6%的膽固醇和1 002.4 μg/g蝦青素。不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）和PUFA分別占總脂肪酸的65.9%和32%。

DSS 美國MP Biomedicals公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒 武漢博士德生物公司；內毒素（lipopolysaccharides，LPS）ELISA檢測試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）檢測試劑盒 森貝伽生物科技有限公司；cDNA反轉錄試劑盒、TB GreenTMPremix ExTaqTM熒光定量試劑盒 日本TaKaRa公司；核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗體 美國Abcam公司；Keap1抗體 美國Santa Cruz Biotechnology公司；β-actin抗體 美國Cell Signaling Technology公司；其余實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

IXS 1型倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Multiskan FC全自動酶標儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機 上海如湘儀器有限公司；MyCycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司；ABI ViiATM實時熒光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）儀（含F(xiàn)TC-3000實時檢測系統(tǒng)） 美國Applied Biosystems公司；ChemiScope series化學發(fā)光成像儀 上海勤翔科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗設計

小鼠抵達實驗室后在飼養(yǎng)環(huán)境（12 h/12 h光暗循環(huán)、溫度（22±2）℃、相對濕度（60±5）%）適應5 d。實驗期間提供基礎飼料和自由飲水。動物實驗方案的制定與執(zhí)行均依照浙江海洋大學實驗動物護理倫理委員會的批準和指導開展（編號：2019003）。

將小鼠隨機分為4 組（n＝6）：對照組、DSS組、低劑量AKO組（L-AKO，0.25 g/（kgmb·d））和高劑量AKO組（H-AKO，0.5 g/（kgmb·d））。第1～21天，L-AKO組和H-AKO組小鼠每天分別給予0.25、0.50 g/kg AKO灌胃，對照組和DSS組小鼠給予等體積純水灌胃處理；第14～21天，除對照組外的其他實驗小鼠每天給予含有質量分數(shù)3.5% DSS的飲用水以誘導產(chǎn)生實驗性UC。實驗期間記錄小鼠行動飲食狀態(tài)。實驗結束后對小鼠實行人道處死，收集小鼠盲腸至直腸區(qū)域腸道（即結腸組織），保存在-80 ℃用于后續(xù)分析。

1.3.2 H&E染色

用體積分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定新鮮結腸組織，進行一系列標準乙醇溶液梯度脫水，石蠟包埋、切片（厚度4 μm）、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色、制片。使用帶有計算機輔助成像分析系統(tǒng)的顯微鏡下放大觀察，記錄結腸組織切片。

1.3.3 生化指標檢測

準確稱取部分結腸組織，按1∶9（m/V）的比例加入磷酸鹽緩沖液，在組織勻漿器中進行均質。使用高速冷凍離心機在4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，收集離心后的上層液體保存，即結腸組織勻漿液樣品。使用ELISA檢測試劑盒分別測定TNF-α、IL-6、LPS的水平，GSH-Px、SOD活力和DAO水平使用對應的試劑盒進行檢測SOD活力結果以蛋白質量計，GSH-Px活力以其濃度計。

1.3.4 抗氧化相關基因相對表達量的測定

結腸組織在液氮中粉碎后與TRIzol試劑充分混合均勻，靜置分離以提取總RNA，并使用瓊脂糖凝膠電泳驗證質量。將提取到的總RNA作為模板使用反轉錄合成試劑盒合成cDNA。隨后，各組cDNA樣品利用TB GreenTMPremix ExTaqTM熒光定量試劑盒進行處理后，再上樣進行qPCR，利用實時檢測系統(tǒng)進行定量分析。以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。實驗所需引物序列參考表1合成。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.5 蛋白相對表達量測定

取部分結腸組織使用液氮進行粉碎，加RIPA裂解緩沖液裂解細胞提取總蛋白。調整各提取樣品的蛋白總量為20 μg用于Western blot分析。所有樣品蛋白上樣于質量分數(shù)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，隨后截取目標蛋白區(qū)域置于已被甲醇活化的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）上印跡。使用質量分數(shù)5%脫脂牛奶稀釋液封閉PVDF膜后，依次在一抗和二抗稀釋液中進行孵育。所用一抗分別為：Keap1、Nrf2、β-actin，均按1∶1 000比例稀釋。在化學發(fā)光成像儀下觀察記錄蛋白條帶，并使用ImageJ軟件計算目標蛋白灰度。以β-actin為內參蛋白，對目標蛋白的相對表達進行歸一化計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Prism version 7.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析進行多組間的差異性分析，P＜0.05時表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 AKO對UC小鼠一般行為情況的影響

在實驗期間，僅喂食標準飲食的對照組小鼠表現(xiàn)活躍、行動迅捷、毛發(fā)光潔。DSS藥物干預3 d后，小鼠出現(xiàn)進食和飲水減少、行動遲緩、活力下降等現(xiàn)象，后期可觀察到腹瀉便血，體質量迅速下降。攝入AKO后的小鼠在行動、毛發(fā)、飲食飲水、糞便方面均得到了改善，并在一定程度上緩減DSS造成的體質量降低。

2.2 AKO對UC小鼠結腸組織結構的影響

如圖1所示，對照組小鼠結腸上皮細胞和隱窩結構完整，無潰瘍和炎癥細胞浸潤。而DSS干預后腸道結構嚴重受損，部分腸壁增厚，隱窩結構和杯狀細胞扭曲，腺體結構異常，黏膜下炎癥細胞浸潤。這些癥狀表明DSS誘導的小鼠UC造模成功。L-AKO和H-AKO處理均可顯著改善DSS造成的腸道損傷、組織潰爛，恢復基本結構。H-AKO在維持結腸結構完整且不引起大量炎癥方面有更好的效果，提示AKO可以有助于UC小鼠的腸道恢復。

圖1 各組小鼠結腸組織H&E染色結果（100×）Fig.1 H&E staining results of colonic tissues of mice in each group (100 ×)

2.3 AKO對UC小鼠結腸組織炎癥因子的影響

炎癥因子是體內炎癥反應的重要信號分子，它們的表達水平與UC的嚴重程度呈正相關[17]。通過ELISA檢測試劑盒測定炎癥因子IL-6和TNF-α在結腸組織的表達水平，用以評價機體的炎癥反應，結果如圖2所示。與對照組相比，DSS組小鼠結腸中IL-6、TNF-α的表達水平顯著升高（P＜0.05）。與DSS組相比，不同劑量AKO處理后均可以降低炎癥因子IL-6、TNF-α的表達水平。其中，H-AKO處理組的IL-6、TNF-α表達水平更接近對照組（P＞0.05）。提示攝入AKO有利于降低體內炎癥因子水平從而緩解UC小鼠炎癥反應。

圖2 AKO對UC小鼠結腸組織中炎癥因子IL-6（A）和TNF-α（B）水平的影響Fig.2 Effect of AKO on the levels of inflammatory factors IL-6 (A)and TNF-α (B) in colon tissues of UC mice

2.4 AKO對UC小鼠結腸通透性的影響

腸道組織是機體免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，LPS和DAO的含量可以間接反映腸道屏障的損傷程度[18]。從圖3可看出，與對照組相比，DSS誘導后的小鼠結腸內DAO和LPS水平顯著升高（P＜0.05），AKO處理能明顯降低DSS誘導后小鼠結腸內的DAO和LPS的水平，其中H-AKO具有顯著性的效果（P＜0.05）。結果提示AKO可顯著改變小鼠的腸道通透性，維持腸道屏障完整和功能，抵御有害物質侵襲機體。

圖3 AKO對UC小鼠結腸組織中DAO（A）和LPS（B）水平的影響Fig.3 Effect of AKO on the contents of intestinal permeability indicators DAO (A) and LPS (B) in colon tissues of UC mice

2.5 AKO對UC小鼠結腸中抗氧化酶活力的影響

GSH-Px和SOD的活力可以反映機體的抗氧化能力。如圖4所示，與對照組相比，DSS干預后可以顯著降低抗氧化酶GSH-Px、SOD在小鼠結腸內的活力（P＜0.05），提示小鼠體內抗氧化能力下降。與DSS組相比，不同劑量AKO處理后結腸組織內GSH-Px和SOD活力出現(xiàn)了不同程度的提高。其中H-AKO處理與L-AKO處理結果相比更接近對照組GSH-Px和SOD活力水平。結果顯示攝入H-AKO有助于增強炎癥狀態(tài)下的結腸組織中相關抗氧化酶活力，改善UC小鼠體內的抗氧化能力。

圖4 AKO對UC小鼠結腸組織中抗氧化酶GSH-Px（A）和SOD（B）活力的影響Fig.4 Effect of AKO on the activity of antioxidant enzymes GSH-Px (A)and SOD (B) in colon tissues of UC mice

2.6 AKO對UC小鼠結腸抗氧化相關基因表達水平的影響

為了進一步探討AKO對UC小鼠體內的抗氧化影響，利用qPCR對Nrf2/Keap1信號通路中控制的下游抗氧化酶基因表達進行了驗證。如圖5所示，與對照組相比，DSS誘導后能顯著降低結腸組織中SOD、GSH-Px及Nrf2/Keap1通路中II期下游HO-1基因的表達水平（P＜0.05），顯著提高Nrf2基因的表達水平（P＜0.05）。H-AKO處理可以顯著增加DSS干預后的小鼠結腸中SOD、GSHPx、Nrf2、HO-1基因表達水平，并且接近正常水平（P＞0.05）。提示H-AKO處理可以提高UC小鼠體內的相關抗氧化基因表達，以抵抗腸道氧化應激損傷。

圖5 AKO對UC小鼠結腸組織抗氧化相關基因SOD（A）、GSH-Px（B）、Nrf2（C）、HO-1（D）表達水平的影響Fig.5 Effect of AKO on the expression levels of antioxidant genes SOD (A), GSH-Px (B), Nrf2 (C), and HO-1 (D) in colon tissues of UC mice

2.7 AKO對Nrf2/Keap1信號通路的影響

使用Western blot法檢測Nrf2/Keap1通路中的關鍵蛋白水平，用于進一步評價AKO對UC小鼠體內抗氧化機制的影響。在正常情況下，Keap1與Nrf2在細胞質中結合，當機體受到某種刺激后，Keap1-Nrf2的結合不穩(wěn)定，Nrf2被釋放出來并轉移到細胞核內進行后續(xù)反應，這對于各種靶基因的反式激活必不可少[19]。如圖6所示，AKO處理組與DSS組、對照組相比結腸內Nrf2表達水平增加，Keap1表達水平降低，并具有劑量依賴性（P＜0.05）。這些結果證明AKO可能是通過調節(jié)Nrf2/Keap1信號通路從而改善UC小鼠的氧化損傷。

圖6 AKO對UC小鼠結腸組織中Nrf2/Keap1信號通路的影響Fig.6 Effect of AKO on Nrf2/Keap1 signal pathway in colonic tissues of mice

3 討 論

UC是一種引起患者腹部疼痛的慢性腸道疾病，由于藥物治療通常會伴隨著嚴重的副作用且難以完全治愈，因此預防和尋找安全高效的治療方法成為人們關注的重點[20]。飲食是維持人體健康與生長的關鍵因素，通過飲食干預進行預防和調節(jié)UC發(fā)展是行之可效的[21]。AKO富含多種活性物質，是一種新型且受歡迎的食品補充劑。本實驗通過AKO干預動物實驗，研究其對DSS誘導造成UC小鼠氧化損傷的保護作用。

研究表明UC的發(fā)病機制與腸道炎癥、異常氧化應激和腸道屏障損傷等因素密切相關[22]。在活動性腸道炎癥的發(fā)生過程中，先天反應表現(xiàn)為炎癥黏膜中白細胞浸潤水平的升高，導致氧化應激損傷[23]。TNF-α和IL-6是體內重要的炎癥調節(jié)因子。TNF-α可促進其他炎癥因子產(chǎn)生，引起黏膜炎癥和腸道屏障損傷。IL-6與機體的炎癥、免疫應答密切相關，過度表達導致免疫紊亂并加劇炎癥[24]。徐寶琪等對不同狀態(tài)下的UC患者進行血清檢測，結果表明，與正常人相比，其體內TNF-α和IL-6水平顯著性升高[25]。本實驗結果顯示H-AKO處理可顯著降低DSS干預后結腸組織中IL-6、TNF-α的表達水平（P＜0.05）。Kim等研究表明AKO脂質體可以極大地抑制脂多糖誘導的RW254.6巨噬細胞促炎因子的產(chǎn)生[26]。n-3 PUFAs可通過多種方式降低炎癥反應，包括減少促炎轉錄因子的分泌、影響膜脂肪酸組成從而維護細胞形態(tài)、激活過氧化物酶體增殖受體來提高抗氧化能力等[27]。這提示H-AKO處理可以有助于減少炎癥因子的分泌，改善UC小鼠結腸炎癥。

此外，炎癥因子通過NF-κB通路進一步參與到DSS干預造成的腸道屏障損傷[28]。完整的結腸上皮屏障是維持正常腸道功能的基礎條件[29]。黃循銣等實驗表明2.5% DSS定量灌胃誘導的結腸炎小鼠出現(xiàn)了結腸上皮組織潰爛、出血、腸道通透性增加等現(xiàn)象[30]。腸道屏障受損時，腸上皮細胞剝離溶解使DAO被釋放到管腔內，LPS從死亡革蘭氏陰性菌細胞壁中釋放到腸道中進入機體循環(huán)導致炎癥反應加劇[31]。因此，腸道內LPS和DAO水平可間接反映腸道屏障的損傷程度。實驗結果顯示，在DSS的炎性刺激環(huán)境下，腸道中的DAO和LPS水平升高，小鼠腸道屏障的完整性被破壞。與DSS組相比，H-AKO處理可改善結腸組織結構受損和組織潰爛，并降低LPS和DAO水平（P＜0.05）。AKO脂質體在腸道屏障模型中表現(xiàn)出可以完全恢復炎癥受損的膜道屏障[26]。這提示H-AKO處理有助于維護UC小鼠正常的腸道屏障結構與功能。

氧化應激異常通常被認為是UC進展的關鍵。在UC患者中可觀察到中性粒細胞產(chǎn)生過多活性氧，進而攻擊破壞關鍵大分子，擾亂細胞內穩(wěn)態(tài)，導致組織出現(xiàn)氧化損傷，從而加速和延長炎癥反應[32]。同時，氧化應激對腸道屏障的功能和結構完整性產(chǎn)生破壞作用，引發(fā)腸內穩(wěn)態(tài)失調[33]。SOD是參與保護組織免受氧化損傷的重要抗氧化酶之一，可調節(jié)體內代謝產(chǎn)生超氧陰離子自由基，并聯(lián)合下游相關過氧化物酶對其進行徹底清除。GSH-Px作為一種過氧化物分解酶，被認為是機體抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，可保護細胞免受活性氧造成的損傷[34]。實驗結果表明，與對照組相比，DSS組小鼠的SOD和GSH-Px活力均呈現(xiàn)明顯下降，提示DSS誘導造成了小鼠抗氧化防御系統(tǒng)功能失常；而通過AKO處理后可以逆轉該下降趨勢，這可能與KO的組分具有抗氧化作用相關。n-3 PUFAs因其結構中的不飽合鍵具有一定抗氧化性[35]，蝦青素作為天然的強抗氧劑能高效清除體內自由基[36]，謝丹在AKO抗氧化功能評價的研究中發(fā)現(xiàn)磷脂的存在亦可發(fā)揮次級抗氧化作用[37]。研究證實通過使用外源性抗氧化物和增加機體內抗氧化系統(tǒng)基因的表達可以預防UC發(fā)生[4]。Grimstad等研究表明攝入富含高濃度的蝦青素和n-3 PUFAs的AKO可達到減輕自身炎癥的氧化應激[16]。提示AKO可能通過發(fā)揮自身抗氧化能力和增強體內抗氧化酶活性的協(xié)同作用達到減少UC小鼠氧化應激反應。

Nrf2是維持細胞內氧化還原平衡反應的一種重要轉錄因子，參與多種應激反應、誘導相關保護酶及相關蛋白如SOD、GSH-Px和HO-1[38]的轉錄。在Nrf2/Keap1信號通路中，Keap1通過泛素化、偶聯(lián)和降解等作用對Nrf2表達進行負調控，從而影響Nrf2結合抗氧化元件來控制下游抗氧化基因的轉錄，起到抗氧化作用[19]。HO-1是主要抗氧化應答者之一，是Nrf2/Keap1信號通路的關鍵靶基因[39]。Nrf2可誘導HO-1表達上調，抑制炎癥介質的產(chǎn)生和釋放，起到抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用，保護細胞[40]。Hye-Won等研究表明攝取n-3 PUFAs可以有效抵抗三硝基苯磺酸介導的野生型UC小鼠中炎癥和脂肪氧化，并抑制NF-κB通路和激活Nrf2通路中相關目標基因的表達[41]。王蕾研究表明攝入不同比例的PUFAs可以通過調節(jié)Nrf2抗氧化通路來改善DSS誘導的UC小鼠體內抗氧化能力[35]。Helal等研究表明AKO可在鐵超載大鼠體內上調Nrf2的表達來降低氧化應激[42]。Wen Chengfei等研究表明AKO通過Nrf2/Keap1信號通路減弱冠心病患者的氧化應激[43]。這些研究表明攝入AKO可影響Nrf2信號通路，緩減機體的氧化應激狀態(tài)。本研究結果表明小鼠在受到DSS刺激后啟動了Nrf2抗氧化通路，但沒有改善氧化應激狀態(tài)。給予AKO處理后可增加小鼠結腸內的Nrf2及相關抗氧化酶的基因表達，增強了結腸組織抗氧化能力。Western blot分析結果表明AKO處理與對照組和DSS組相比，可以增加Nrf2蛋白表達，并抑制Keap1蛋白表達。這些結果表明攝入AKO可以通過激活Nrf2/Keap1信號通路影響UC小鼠體內的抗氧化系統(tǒng)。

綜上所述，AKO在UC小鼠腸道中表現(xiàn)出顯著的抗氧化功能。AKO激活Nrf2/Keap1信號通路中蛋白和基因表達，增強體內抗氧化酶的活力，減輕機體氧化應激，并降低炎癥反應和維持腸道屏障功能。這些結果揭示了AKO在UC小鼠中的保護作用及可能抗氧化機制，可為AKO作為功能性食品或其他輔助材料提供參考，也為海洋資源的開發(fā)和利用提供啟發(fā)。