探討白介素-6對糖尿病周圍神經病變的干預性作用及機制

張春風，鄭輝*，葛煥琦，謝云，李雪粉，胡睿，郭夏

（1.泰達國際心血管病醫院內分泌科，天津 300134；2.天津醫科大學朱憲彝紀念醫院（天津市內分泌研究所）國家衛生健康委員會激素與發育重點實驗室（天津市代謝性疾病重點實驗室），天津 300134）

糖尿病是一個嚴重的公共健康問題，國內流行病學調查顯示，中國成年人糖尿病的患病率為11.2%[1]，周圍神經病變是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，國外研究證實超過50%的糖尿病患者可診斷為周圍神經病變[2]。周圍神經病變是導致糖尿病患者足部潰瘍、下肢截肢及骨折的危險因素，必須進一步尋找針對神經病變的病因性治療方法[3]。目前，糖尿病神經病變的發病機制尚未完全明確，已知的是長期高血糖狀態及相關代謝紊亂是導致神經病變的主要原因。實驗和臨床證據表明，長期高血糖狀態介導的細胞功能障礙通過氧化應激、細胞因子釋放和神經炎癥在神經損傷中起關鍵作用[4-5]。Christian等[6]研究首次證實炎癥與糖尿病周圍神經病變的相關性，尤其IL-6水平增加與神經病變和神經缺陷明顯相關，但該研究是橫斷面的觀察性研究，未能明確炎癥因子與神經病變的因果關系且未進行干預性的研究。

IL-6屬于IL-6細胞因子家族成員，分子量為21 kD，由184個氨基酸殘基組成，并含有2個糖基化位點。IL-6主要由單核巨噬細胞、Th2細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞產生，且骨髓細胞和部分腫瘤細胞等也可產生IL-6。IL-6是一種多效性細胞因子，能調節多種細胞功能，包括細胞增殖、細胞分化、免疫防御機制及血細胞生成等。有研究者通過動物試驗應用不同劑量IL-6對糖尿病周圍神經病變大鼠進行干預后發現，IL-6以劑量依賴的方式提高感覺運動神經纖維傳導速度，溫度覺感覺過敏，以及坐骨神經內皮血流灌注[7]，但該研究未能證實IL-6干預后神經組織病理性改變及其作用機制。

本研究通過對不同水平IL-6對糖尿病大鼠進行干預后觀察腓腸神經病理學改變及炎癥相關因子NF-κB，I?Bα的表達水平影響，旨在探討IL-6對周圍神經病變的干預性作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 2015年10月至2018年12月，選取80只健康雄性清潔級wistar大鼠，均購自天津醫科大學動物試驗中心，體質量為（200±30）g，將大鼠隨機分為對照組、糖尿病非干預組、糖尿病低劑量IL-6干預組、糖尿病高劑量IL-6干預組，每組20只。

1.2 制備動物模型及IL-6干預 對照組喂予基礎飼料，糖尿病大鼠喂予高脂高糖飼料（20%蔗糖，10%豬油，5%膽固醇，1%膽酸，64%標準飼料）。各組大鼠飼養條件相同，自由攝食、飲水，室溫控制在20～25℃，濕度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗。

1.2.1 制備糖尿病周圍神經病變模型 糖尿病大鼠給予尾靜脈注射鏈脲菌素45 mg/kg，并持續高糖高脂飼料喂養；對照組注射相當劑量的檸檬酸鈉緩沖液并予普通飼料。造模1周后尾靜脈采血測定隨機血糖＞16.7 mmol/L為糖尿病造模成功。繼續上述喂養方法和條件8周制備周圍神經病變模型。

1.2.2 不同劑量IL-6干預 低劑量IL-6干預組給予1μg/kg IL-6，每周3次，皮下注射；高劑量IL-6干預組給予10μg/kg IL-6，每周3次，皮下注射；對照組及非干預組給予等體積0.9%氯化鈉溶液皮下注射。干預期4周。對照組共18只完成試驗，非干預組有15只完成，低劑量IL-6干預組有16只完成，高劑量IL-6組有16只完成。

1.3 標本處理 大鼠隔夜空腹12 h，心臟取血2管，1管抗凝，1管迅速離心，-4℃保存留檢，分離大鼠雙側腓腸神經，液氮保存。

1.4 血液生化指標檢測 應用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司）測定大鼠血IL-6的水平；采用高效液相色譜法測定大鼠糖化血紅蛋白。

1.5 腓腸神經病理學改變 取一側腓腸神經，經固定，石蠟包埋，切片，HE染色觀察腓腸神經病理學改變。

1.6 大鼠腓腸神經IL-6，NF-κB及I?Bα的mRNA及蛋白表達 取一側大鼠腓腸神經組織，采用Western blot法測定IL-6、NF-κB及I?Bα蛋白表達水平，相關抗體購自武漢博士得生物工程有限公司。

應用定量實時聚合酶鏈反應監測大鼠另一側腓腸神經IL-6、NF-κB及I?BαmRNA表達量。取冰凍腓腸神經，用超純RNA提取試劑（TaKaRa Code D9108B）提取組織樣本中總RNA。IL-6：F：5'CACTTCACAAGTCGGAGGCT3'；R：5'TCTGACAGTGCATCATCGCT3'；NF-κB：F：5'GGCATCCACCATGGAAGACA3'；R：5'CGTAACCGCGTAGTCGAAGA3'；I?Bα：F：5'TGGCAAGGTCATGCTCTCAG3'；R：5'GGAAGCAGGAATGGAGCTGA3'；內參Actin：F：5'AAGAGGGATGCTGCCCTTAC3'；R：5'TACGGCCAAATCCGTTCACA3'。

取5μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，用反轉錄試劑盒中的gDNA Eraser（TaKaRa code DRRO47A）對RNA中殘留的基因組DNA進行消化處理，用反轉錄試劑盒（TaKaRa code DRRO47A）進行反轉錄，用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以“±s”表示，多組間比較應用方差分析，兩兩比較應用LDS法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生化指標比較 非干預組、低劑量IL-6組和高劑量IL-6組體質量均低于對照組，糖化血紅蛋白水平明顯高于對照組，血IL-6水平高于對照組，且低劑量組血IL-6水平低于非干預組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 4組大鼠生化指標比較（±s）Table1 Comparation of biochemical index among four groups(±s)

表1 4組大鼠生化指標比較（±s）Table1 Comparation of biochemical index among four groups(±s)

注：IL-6，白細胞介素-6。與對照組比較，a P＜0.05；與非干預組比較，b P＜0.05；與低劑量IL-6組比較，c P＜0.05

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2.2 4組大鼠腓腸神經病理學改變 對照組大鼠腓腸神經結構清晰，形態正常，未見明顯異常；非干預組神經結構清晰，形態正常，纖維密度減少，截面積減小，呈萎縮趨勢，神經纖維間隙擴大，密度不均勻，可見少量異常有髓纖維；低劑量IL-6干預組部分神經纖維排列稍紊亂，偶見異常有髓纖維；高劑量IL-6干預組部分神經纖維輕度水腫變性，排列稍紊亂，偶見異常有髓纖維，見圖1。

圖1 各組大鼠腓腸神經病理改變Table 1 Comparation of biochemical index among four groups

2.3 4組大鼠腓腸神經炎癥相關因子mRNA表達水平比較 非干預組、低劑量IL-6組和高劑量IL-6組腓腸神經IL-6、NF-κB及I?Bα的mNRA表達均高于對照組，其中非干預組大鼠的炎癥因子mRNA升高最明顯，低劑量IL-6組IL-6及I?Bα的mRNA表達與非干預組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；經高劑量IL-6干預后，上述炎癥因子mRNA的表達進一步下降，與非干預組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 4組大鼠腓腸神經炎癥相關因子mRNA表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of mRNA expression of sural nerve inflammation related factors among four groups(±s)

表2 4組大鼠腓腸神經炎癥相關因子mRNA表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of mRNA expression of sural nerve inflammation related factors among four groups(±s)

注：IL-6，白介素-6；NF-κB，核因子κB；I?Bα，抑制蛋白α。與對照組比較，a P＜0.05；與非干預組比較，b P＜0.05；與低劑量IL-6組比較，c P＜0.05

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2.4 4組大鼠腓腸神經炎癥相關因子蛋白表達水平比較 應用Image J軟件分析灰度值，各組大鼠腓腸神經IL-6，NF-κB及I?Bα蛋白表達，見圖2。與對照組比較，非干預組、低劑量IL-6組和高劑量IL-6組腓腸神經IL-6、NF-κB及I?Bα蛋白表達水平均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。經低劑量IL-6干預后，上述炎癥因子蛋白表達水平有下降，其中IL-6和NF-κB表達水平與非干預組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。經高劑量IL-6干預后，上述炎癥因子表達水平進一步下降，與非干預組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 4組大鼠腓腸神經炎癥相關因子蛋白表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of protein expression of sural nerve inflammation related factor among four groups(±s)

表3 4組大鼠腓腸神經炎癥相關因子蛋白表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of protein expression of sural nerve inflammation related factor among four groups(±s)

注：IL-6，白細胞介素-6；NF-κB，核因子κB；I?Bα，抑制蛋白α。與對照組比較，a P＜0.05；與非干預組比較，b P＜0.05；與低劑量IL-6組比較，c P＜0.05

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圖2 各組大鼠腓腸神經炎癥因子蛋白表達水平Figure 2 Protein expression of sural nerve inflammatory factor in each group

3 討論

在1985年，IL-6首次被確定為B細胞刺激因子，并被描述為啟動免疫系統急性期反應的促炎細胞因子[8]。在糖尿病周圍神經病變患者的血液中發現IL-6水平升高，提示IL-6可能與神經病變發生發展相關。后續的臨床研究中發現在給予糖尿病周圍神經病變患者進行運動指導時，血液IL-6水平呈脈沖式升高，且伴隨血流量增強和慢性炎癥減少，促進周圍神經纖維再生的作用；動物實驗中經實驗性切開軸突后可觀察到IL-6在神經中過度表達，從而促進軸突生長，直到與施萬細胞建立接觸。因此，目前IL-6被理解為一種多功能細胞因子，既可激發炎癥，也有抗炎作用[9]。目前比較一致的觀點認為，當IL-6的水平達到10～100 pg/ml時（類似于運動時IL-6的短暫脈沖式突然增高），IL-6對于糖尿病神經病變表現為改善和修復作用，然而對于長期慢性低劑量IL-6水平的升高（2～3 pg/ml）時，IL-6表現為炎癥效應，可能促進糖尿病神經病變的進一步進展[10]。

本研究結果表明，長期高血糖狀態下大鼠血液IL-6水平高于非糖尿病大鼠，然而給予外源性IL-6干預后，大鼠腓腸神經IL-6的mRNA及蛋白表達受到抑制，病理下可見神經結構較前改善，提示IL-6對周圍神經病變起到保護性作用。

既往國外動物實驗中發現外源性給予IL-6干預后，大鼠周圍神經傳導速度，熱痛覺感知均得到改善，然而并未進一步分析IL-6的作用機制[7]。NFκB被認為是炎癥反應的中心環節。NF-κB的過度表達導致神經炎癥的發展，促炎細胞因子的產生，神經損傷，運動神經傳導速度異常。NF-κB可表達于任何細胞，通常以無活性形式存在，在炎癥因子刺激下NF-κB被激活，轉運入細胞核內并調控目標基因的表達。本研究結果表明，應用IL-6進行干預后，大鼠腓腸神經NF-κB及I?Bα的mRNA及蛋白表達均受到抑制，并且呈現為劑量依賴方式，提示IL-6可能通過抑制NF-κB的表達從而起到改善神經形態及功能的作用。

既往研究[11]發現IL-6有改善糖代謝及胰島素敏感性的作用，但本研究中應用IL-6后對于糖化血紅蛋白的改善作用不明顯，考慮可能與干預時間短相關，關于IL-6與血糖及胰島素的相關性需要進一步實驗證實。

綜上所述，IL-6可通過抑制腓腸神經NF-κB的表達，緩解糖尿病大鼠周圍神經病變的進展。