結核分枝桿菌H37Ra感染的THP-1細胞TGF-β1、Smad2、Smad3、TNF-α、IL-6 mRNA表達變化

王立楠，李艷寧，劉建，屈昱良，，郭樂，楊宗強，牛寧奎

1 寧夏醫科大學總醫院骨科，銀川 750004；2 寧夏醫科大學；3 寧夏醫科大學臨床醫學院寧夏臨床病原微生物重點實驗室

結核病是由結核分枝桿菌（MTB）感染導致的一類慢性傳染性疾病，據2020年全球結核病報告顯示，雖然結核病發病率在逐年下降，2018－2019年期間的結核病發病率較上一年減少了2.3%，但目前它仍是世界上十大死亡疾病原因之一，中國結核病患者總人數占全球結核病患者總人數的8.4%，位居世界第三位。因此，迄今為止，結核病還是我國重點防控的傳染病之一。當MTB 通過呼吸道、破損的皮膚、消化道進入患者體內后，巨噬細胞作為人體內最為重要的免疫效應細胞，具有強大的吞噬能力，是機體抵御MTB進入機體的第一道重要防線［1］。巨噬細胞吞噬MTB 后可啟動凋亡、自噬等免疫相關機制清除和防御MTB，還可作為抗原提呈細胞啟動T 細胞介導的細胞免疫應答和B 細胞介導的體液免疫應答［2］。在結核病中，轉化生長因子-β（TGF-β）是一類在結構上相似的轉化生長因子，分為TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3 三種亞型［3］，其中75%為TGF-β1，由多種細胞產生，可發揮免疫抑制、抗炎、促進成纖維細胞和巨噬細胞聚集、組織損傷修復及骨組織的修復與重建等作用［4］。Smads 蛋白是TGF-β 家族從細胞膜受體到細胞核的胞內信號轉導分子［5］。TGFβ1 對下游信號通路的調控包括依賴于Smads 蛋白的經典通路途徑和不依賴于Smads蛋白的非經典通路途徑，其中經典途徑為主要調控通路［6］。TGF-β1主要是通過Smad2/3 來發揮其抗炎作用，Smad2/3在TGF-β1/Smads 經典信號通路中處于重要位置［7］。在結核病中，感染MTB 菌量不同引起的機體免疫反應強弱也不同，TGF-β1/Smads經典信號通路的激活程度是否與MTB感染的細菌量有關，被激活的TGFβ1/Smads 經典通路主要在MTB 感染后的哪個時間階段發揮主要作用的研究甚少。2020年1月—2021年6月，本研究觀察了MTB H37Ra 在不同感染時間和不同感染復數下感染THP-1 細胞后TGF- β1/Smads 經典信號通路中的關鍵基因TGF-β1、Smad2、Smad3及炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）基因表達變化，為進一步探究TGF-β1/Smads經典信號通路在MTB感染的巨噬細胞中可能的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑、儀器及來源 THP-1 巨噬細胞、MTB H37Ra 均由本實驗室液氮罐及-80 ℃冰箱保存；RPMI 1640 培 養 基 購 自Biological Industries 公司；胎牛血清購自Gemini 公司；羅氏改良培養基購自賽諾特生物公司；TRIzol 試劑購自Invitrogen 公司；基因序列從NCBI 網站Gene Bank 網站獲取，由NCBI Primer-BLAST 在線網站設計基因正反引物序列，由上海生工生物工程公司負責合成引物；逆轉錄試劑盒與實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試劑盒購自大連寶生物TaKaRa 公司；熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司（Applied Biosystems 7600 系統）；雙光束紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限公司；超聲細胞粉碎機購自寧波新藝超聲設備有限公司。

1.2 THP-1巨噬細胞、MTB H37Ra的培養 從液氮罐中取出THP-1 細胞，在37 ℃水浴中快速解凍細胞，在含有10% 胎牛血清（FBS）的RPMI1640 培養基、37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，每48 h在顯微鏡下觀察細胞狀態和濃度，使用牛鮑計數板進行細胞計數，培養細胞濃度至1×106/mL時，接種細胞至6孔板中，每孔2 mL，然后加入終濃度為100 ng/mL佛波酯，繼續培養24 h，THP-1 細胞由單個圓形細胞轉變為形態不規則，具有偽足的貼壁細胞，棄去六孔板中培養基，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2 遍，每孔加入不含抗生素的10% FBS 的RPMI1640 培養基2 mL，待用。

從低溫-80 ℃冰箱中取出生長在改良羅氏培養基表面的MTB H37Ra，移至生物安全柜進行操作。在培養箱中解凍30 min，待培養基表面的菌落可被挑下時，挑取適量H37Ra 菌團，轉移至高壓滅菌過的玻璃組織均漿器中，加入5 mL PBS，反復研磨均勻后，用巴氏吸管轉移至新的改良羅氏培養基斜面，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養2～3 周后，可見培養基斜面生長散落的黃色菜花狀菌落，用接種環刮取長勢良好的單個菌落的細菌，置于5 mL EP 管中，然后加入2 mL PBS；將EP 管置于冰上，用細胞超聲破碎儀將成團的細菌處理為單個的菌，設置條件：功率5 W、工作15 s、停15 s，總時間5 min；超聲結束后200 g 10 min低速離心，吸取上層菌懸液轉移到新的5 mL EP 管中，使用紫外分光光度儀在OD600 波長條件下，檢測H37Ra 菌懸液OD600 值，帶入公式CFU=3.26×107×OD600 + 6.89×105，計算得到H37Ra菌懸液濃度［8-9］，待用。

1.3 THP-1 細胞中MTB H37Ra 的加入方法 在前期處理好的THP-1 細胞中加入H37Ra 菌液（觀察組），根據六孔板中每孔THP-1細胞數量和感染復數（MOI）即細菌與細胞的比例加入相對應量的H37Ra菌懸液，調整MOI 為1∶1、10∶1、100∶1（即MOI=1，10，100），繼續置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養6 h后更換新鮮的不含抗生素10% FBS 的RPMI1640 培養基2 mL，更換前用PBS 洗去未進入THP-1 細胞內的H37Ra，繼續培養至24 h；在感染復數MOI=10 的條件下，置于37 ℃、5% CO2培養箱中，在共培養6 h后更換新鮮的不含抗生素的10% FBS RPMI1640 培養基2 mL，然后繼續培養至12 h，24 h 后收集細胞。對照組均為未感染H37Ra的細胞。

1.4 MTB H37Ra 感染的THP-1 細胞中TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 檢測 采用qRT-PCR 法 根據共培養時間的不同，按時間棄去六孔板中培養基，用PBS清洗2～3遍，每孔加入1 mL TRIzol按照參考說明書步驟提取每孔中細胞總RNA，使用Nanodrop 2000檢測提取總RNA 的濃度及純度，確保OD260/OD280：1.8～2.4，OD260/OD230：1.5～2.4，濃度均大于50 ng/μL。總RNA 質檢合格后，利用反轉錄試劑盒對總RNA 進行反轉錄獲得cDNA，使用StepOnePlus Real-Time PCR System、qRT-PCR 法檢測TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA、TNF- α mRNA、IL-6 mRNA。 TGF- β1 的 上 游 引物：5’GGACCAGTGGGGAAC ACTAC3’，下 游 引 物 序 列：5’AGAGTCCCTGCATCTCAGAGT3’，目標片段大小為123 bp；Smad2 的上游引物：5’GATGCCTGTTGTTTGCCCAG3’，下游引物序列：5’TCTGCCAAAGTGACAGGTCC3’，目標片段大小為138 bp；Smad3 的上游引物：5’TGCTGGTGACTGGATAGCAG3’，下游引物：5’GCTGCAAGGTGAAGATG TCA3’，目標片段大小 為105 bp；TNF- α 的 上 游 引 物：5’CACAGTGAAGTGCTG GCAAC3’，下 游 引 物：5’GATCAAAGCTGTAGGCCCCA3’，目 標 片 段 為75 bp；IL-6 的 上 游 引 物：5’GCTCCTGGTGTTGCCTGCTG3’，下游引物：5’GTTCTGAAGAGGTGAGTGGCTGTC3’，目標片段大小為101 bp；GAPDH 的上游引物：5’CAGGAGGCATTGCTGATGAT3’，下游引物：5’GAAGGCTGGGG CTCATTT3’，目標片段大小為138 bp。由上海生工生物公司合成。按20 μL 反應體系在冰盒上依次添加以下試劑：10 μL TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）、0.8 μL PCR Forward Primer（10 μmol/L）、0.8 μL PCR Reverse Primer（10 μmol/L）、0.4 μL ROX Reference Dye（50×）、6 μL無酶水及2 μL cDNA；反應條件：95 ℃30 s，95 ℃5 s、60 ℃30 s，40 個循環，95 ℃15 s、60 ℃60 s、95 ℃15 s 1 個循環。每個標本均設置3 個平行復孔，實驗結果均重復3 次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參基因，根據2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。對數據進行SW 檢驗（Shapiro-Wilk），符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTB H37Ra 不同感染復數和不同感染時間感染 的THP-1 細 胞 中TGF- β1、Smad2 mRNA、Smad 3 mRNA 表達 H37Ra 感染24 h 時，與空白對照比較，當MOI=1、10 、100 時，TGF-β1 mRNA 的相對表達量先升高后降低，在MOI=10 時表達最高（P均＜0.05）；Smad2 mRNA 的相 對 表 達 量降 低（P均＜0.05）；Smad3 mRNA 相對表達量升高（P均＜0.05）；TNF-α mRNA 和IL-6 MRNA 表達變化趨勢基本一致，在MOI=1、10 時升高不明顯（P均＞0.05），MOI=100時升高（P均＜0.05），見表1。

表1 不同感染時間H37Ra感染THP-1細胞后TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA表達（±s）

表1 不同感染時間H37Ra感染THP-1細胞后TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA表達（±s）

感染時間0 h 6 h 12 h 24 h TGF-β1 mRNA 0.993 ± 0.1351.696 ± 0.2041.845 ± 0.2591.993 ± 0.317 Smad2 mRNA 1.017 ± 0.2270.008 ± 0.0010.010 ± 0.0030.011 ± 0.004 Smad3 mRNA 1.012 ± 0.18117.150 ± 0.27614.910 ± 0.1905.319 ± 0.079

H37Ra MOI=10 時，隨感染時間（T=6 h、12 h、24 h）延長，TGF-β1 mRNA 的相對表達量呈現升高趨勢（P均＜0.05）；Smad2 mRNA 的相對表達量呈降低趨勢（P均＜0.05）；Smad3 mRNA 相對表達量呈先升 高 后 降 低 趨 勢，在T=6 h 最 高（P均＜0.05）；TNF-α mRNA 和IL-6 MRNA 表達變化趨勢基本一致，呈先升高后降低趨勢，在T=12 h 時最高（P均＜0.05），詳見表2。

表2 不同MOI H37Ra感染THP-1細胞后TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA表達（±s）

表2 不同MOI H37Ra感染THP-1細胞后TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA表達（±s）

MOI 01 10 100 TGF-β1 mRNA 0.993 ± 0.1351.282 ± 0.0611.876 ± 0.2531.008 ± 0.310 Smad2 mRNA 1.017 ± 0.2270.011 ± 0.0030.012 ± 0.0020.010 ± 0.002 Smad3 mRNA 1.012 ± 0.1814.872 ± 0.0284.912 ± 0.7877.594 ± 0.880

2.2 MTB H37Ra 不同MOI 和不同感染時間感染的THP-1細胞中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 表達 感染24 h時，觀察組MOI=1時，TNF-α mRNA、IL-6 mRNA分別為5.628 ± 1.033、5.718 ± 1.335；MOI=10 時，TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 分別為5.045 ± 0.109、5.016 ± 0.853；MOI=100 時，TNF- α mRNA、IL-6 mRNA 分 別 為39.210 ± 6.396、48.440 ±13.550。 對照組TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 分別為1.025 ± 0.277、1.054 ± 0.413。隨著MOI 的升高，觀察組TNF-α mRNA 和IL-6 mRNA 表達變化趨勢基本一致，在MOI=1、10時升高不明顯（P＞0.05），MOI=100時升高（P＜0.05）。

在MOI=10 時，不同感染時間（T=6 h、12 h、24 h），觀察組TNF-α mRNA 分別為13.400 ± 2.386、19.950 ± 2.925、5.066 ± 0.434，IL-6 mRNA 分別為13.760 ± 2.484、19.950 ± 1.374、4.931 ± 0.789。H37Ra MOI=10 時，隨感染時間延長，TNF-α mRNA和IL-6 MRNA 表達變化趨勢基本一致，呈先升高后降低趨勢，在T=12 h時最高（P＜0.05）。

3 討論

MTB 是一種嚴格的細胞內寄生菌，當MTB 通過呼吸道、腸道、破損的皮膚等途徑侵入機體后，巨噬細胞是其主要的宿主細胞，而巨噬細胞作為人體固有免疫的第一道防線，既可以通過自噬、凋亡和炎性小體等作用機制殺滅MTB，也可以作為抗原提呈細胞加工提呈抗原啟動獲得性免疫應答，巨噬細胞在識別分枝桿菌細胞壁成分后被誘導分泌TNF-α 和IL-6等因子調控免疫反應［10-12］，TNF-α是一種促炎細胞因子，可以激活巨噬細胞，招募它們到感染部位，并調控結核肉芽腫的形成［13］，導致組織壞死和空腔的形成［14］。IL-6 是一種單鏈糖蛋白細胞因子，能促進T 細胞和B 細胞的轉運和增殖［15］，從而提高機體對結核分枝桿菌的免疫作用。

MTB 在一定條件下會發生免疫逃逸，在宿主細胞內長期潛伏存活，并且把巨噬細胞作為其逃避機體免疫清除機制的一個重要屏障，避免被殺傷而滯留在巨噬細胞內，這些潛伏的MTB 會隨著機體免疫力的變化隨時啟動開始生長，導致結核病的復燃，直接影響著結核病的發生、發展、預后及轉歸。在MTB 定植于身體某個部位導致結核病的發病時，結核性肉芽腫是診斷結核的主要病理特征之一［16］，而巨噬細胞是結核性肉芽腫中最豐富的細胞類型，在組織中的結節、硬化及干酪樣壞死中起關鍵作用，結核性肉芽腫中巨噬細胞極化的類型與肉芽腫的形成密切相關，巨噬細胞分化途徑的不同是肉芽腫內病原菌是否播散的原因之一［17］。結核性肉芽腫的過度產生會緊緊包裹MTB，一方面防止了MTB 的播散，但也會使其逃避抗結核免疫，無法被機體免疫細胞發現和清除，MTB 長期存在于結核性肉芽腫中，處于休眠狀態；當宿主免疫力降低時，MTB 也會再次開始繁殖、生長導致結核病的復發、再燃，TGF-β 是形成結核性肉芽腫的關鍵基因［18］。早期肉芽腫和晚期肉芽腫中的多核巨細胞、上皮樣細胞均有不同程度的TGF-β1 表達［18］。

在結核免疫反應過程中，TGF-β1 可通過抑制T淋巴細胞的激活、抑制T 淋巴細胞的增殖及誘導T淋巴細胞凋亡，降低單核巨噬細胞活性，降低其吞噬結核分枝桿菌的能力，從而降低人體對結核分枝桿菌感染的抵抗力［18］。結核性肉芽腫是結核病主要的病理特征之一，巨噬細胞是結核性肉芽腫中最豐富的細胞類型，TGF-β1 是影響結核性肉芽腫形成的關鍵基因［19］，早期肉芽腫和晚期肉芽腫中的多核巨細胞、上皮樣細胞均有不同程度的TGF-β1 表達［20］。Smads 是TGF-β 家族從細胞膜受體到細胞核的重要胞內作用分子［21-22］，TGF-β與胞膜表面的TGF-βRⅡ受體結合進一步使TGF-βRⅠ募集［23］，使其下游的Smad2 和Smad3磷酸化并與Smad4形成異寡聚物復合物進入細胞核，與其他轉錄因子相互作用發揮生物學效應［24-26］。TNF-α 可由巨噬細胞內源性分泌，具有促進細胞凋亡的作用［27］；IL-6 可抑制由MTB 感染引起的巨噬細胞自噬，其分泌量增加有利于MTB抑制機體先天性免疫應答［28］。

在本研究中，我們利用MTB H37Ra 在不同MOI及不同感染時間條件下感染THP-1 巨噬細胞，發現TGF- β1 mRNA 表 達 均 明 顯 升 高，在MOI=10 時，TGF-β1 mRNA 的相對表達量最高，MOI=100 時，相對表達量下降，且發現已誘導貼壁的THP-1 巨噬細胞一半數量發生死亡，而MOI=10的THP-1巨噬細胞狀態良好，考慮菌量過多導致細胞死亡，因此本研究在做不同時間感染模型時我們選擇了MOI=10。在感染24 h 內，TGF-β1 mRNA 表達呈現出時間依懶性，在隨著感染時間的延長表達水平持續升高，已有研究發現TGF-β1可降低巨噬細胞表面受體活性［29］，降低其吞噬功能［30］，誘導CD4+T細胞發生凋亡［31］，抑制CD8+T 細胞功能［32］，有利于MTB 逃避機體固有免疫和獲得性細胞免疫系統的殺傷，在機體內存活和繁殖。Smad2 和Smad3 作為TGF-β1 信號通路下游細胞內的主要作用因子，當MOI ＞1 時，Smad 2 mRNA相對表達量顯著降低，但Smad3 mRNA相對表達量升高，MOI 值越大表達量越多，且在MOI=10感染6 h 時表達量最高，之后逐漸下降，因此我們推測在H37Ra感染THP-1后，激活TGF-β信號通路，早期通過激活經典通路上調Smad3 mRNA 的表達，抑制Smad2 mRNA 的表達從而發揮免疫調控作用，晚期可能通過非經典通路抑制機體對MTB 的免疫反應。已有研究發現，在BCG 感染的THP-1 巨噬細胞中，TGF-β1 呈現高表達［33］，且ROSAS-TARACO 等發現沉默小鼠肺內TGF-β1 基因可提高小鼠對MTB 的免疫能力，降低小鼠肺內MTB 數量，增加肺組織中TNF-α的表達，在感染早期可減輕肺組織的纖維化。TGF-β信號通路對細胞免疫和體液免疫均有抑制作用，通過下調TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-12 以及IL-6 等炎癥因子的表達發揮免疫抑制作用［25］。本研究發現，TNF- α mRNA 和IL-6 mRNA 在MOI=100 感 染24 h后相對表達量均明顯高于MOI=1、10，說明在一定范圍內感染MTB 數量越多巨噬細胞免疫反應越強烈，分泌更多的促炎因子。在不同感染時間組中，感染12 h時TNF-α mRNA和IL-6 MRNA相對表達量最高，24 h 時明顯下降，TNF-α 可促進巨噬細胞凋亡，而在12 h 后MTB 誘導的巨噬細胞早期凋亡情況已經趨于穩定，晚期凋亡和壞死的細胞在減少，MTB感染機體后12～24 h 時間段是MTB 發揮逃逸作用的關鍵時期；IL-6 可誘導T 細胞成熟，T 細胞為主的遲發型變態反應是機體清除MTB 的主要途徑，IL-6 晚期表達下降會抑制T 細胞成熟，導致T 細胞無法殺傷結核菌或受結核菌感染的細胞，這也可能是導致MTB慢性感染的原因之一。

綜上所述，相同感染時間，隨著MOI 值增加，結核分枝桿菌H37Ra 感染的THP-1 巨噬細胞中TGFβ1 mRNA 表達先上調后降低，Smad2 mRNA 表達下調，Smad3 mRNA 表 達 上 調，TNF- α mRNA、IL-6 mRNA 相對表達量在MOI=100 時升高；MOI=10時，隨著感染時間延長，結核分枝桿菌H37Ra 感染的THP-1 巨噬細胞中TGF-β1 mRNA 相對表達量升高，Smad2 mRNA 表達下調，Smad3 mRNA 表達先升高，6 h 后降低，TNF-α mRNA 和IL-6 mRNA 表達早期上調，12 h 后降低。說明結核分枝桿菌感染的細菌量與TGF-β1/Smads 經典信號通路的激活程度有關，結核分枝桿菌感染后的12 h 內TGF-β1/Smads經典信號通路發揮主要作用。但由于實驗室生物安全條件限制，本研究使用MTB H37Ra 弱毒株感染THP-1 巨噬細胞與MTB H37Rv 強毒株存在一定差異，其次只在mRNA水平進行了研究，缺少在轉錄后蛋白水平的進一步驗證。