丁苯酞和TLR4 抑制劑預處理對冠狀動脈微栓塞大鼠心肌損傷的改善作用及其機制

黃駿文，陳志清，周游，李浪

1 廣西醫科大學第一附屬醫院心血管內科，南寧 530021；2 前海人壽南寧醫院心血管內科

冠狀動脈微栓塞（CME）指冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂后，斑塊碎片和脂質等致血栓成分流向遠端微小血管引起微循環堵塞，是冠脈介入治療（PCI）的常見并發癥之一［1］。CME容易使冠脈發生“慢血流”或“無復流”，嚴重影響患者預后［2-3］。研究表明，炎性因子參與的心肌組織局部炎性反應，與CME 所致的心肌損傷密切相關［4-5］。

丁苯酞（NBP）在臨床中廣泛用于治療缺血性卒中，具有抗炎［6］、抗氧化應激［7］、抗血小板聚集［8］、減少神經細胞凋亡［9］多種分子靶點。本課題組前期研究發現，NBP 預處理可減輕冠狀動脈微栓塞大鼠心肌炎癥反應并保護心功能［10］。研究顯示，Toll 樣受體4（TLR4）抑制劑聯合右美托咪定能減輕缺氧復氧引起的心肌細胞凋亡和炎癥反應，增強右美托咪定單藥治療效果［11］。然而，NBP聯合TLR4抑制劑能否增強抗炎效應，增強NBP 對CME 大鼠的心肌保護作用仍未明確。2019年6月—2021年6月，本研究通過構建大鼠CME 模型，以單用NBP 作為對照，觀察預先給予NBP 和TLR4 抑制劑的CME 大鼠心臟功能、心肌組織病理及TLR4 通路相關蛋白和炎性因子表達變化，以明確NBP 聯合TLR4 的干預效果是否優于單用NBP，同時探討了NBP 聯合TLR4 抑制劑預處理對CME大鼠心肌損傷的改善作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑及儀器 32 只SPF 級雄性SD大鼠，體質量200～250 g，購自廣西醫科大學實驗動物中心（動物合格證號SYXK 桂2020-0004）。實驗方案通過廣西醫科大學動物福利與倫理委員會審查。直徑45 μm 微栓塞球（美國Polyscience 公司），用生理鹽水調整密度為3×104/mL。丁苯酞軟膠囊（石藥集團恩必普藥業有限公司，批準文號：國藥準字H20050299），用食用植物油調配成80 mg/mL。TLR4抑制劑TAK-242（美國APExBIO公司）。逆轉錄試劑盒及RT-PCR 試劑盒購自Monad 公司。 兔抗鼠TLR4、兔抗鼠MyD88、兔抗鼠NF-κB、兔抗鼠IL-1β、兔抗鼠TNF-α 單克隆抗體、β-actin 單克隆抗體及熒光羊抗兔二抗購自索萊寶科技有限公司。ALCV9A 小型動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技公司）；E-Saote Mylab 彩色多普勒B 超儀（意大利百勝公司）；NanoDrop 分光光度計、StepOnePlus熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；T100 PCR 儀、電泳槽、轉膜儀等（美國Bio-rad 公司）；FluorChem FC3 全能型成像系統（美國proteinsimple 公司）；低溫離心機（德國Eppendorf 公司）；BX50 光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2 大鼠分組及NBP 灌胃、TAK-242 尾靜脈注射、微栓塞球左心室注射 按隨機數字表法將32 只大鼠隨 機分為NBP + TAK-242 組、NBP 組、CME 組、Sham組，每組8只。NBP組CME術前予NBP 80 mg／kg連續灌胃7 d，NBP + TAK-242 組在NBP 組基礎上CME 術 前30 min 按2 mg/kg 尾靜脈注射0.5 mg/mL的TLR4抑制劑TAK-242，其余各組同法注射4 mL/kg的生理鹽水。 CME 術前予3% 戊巴比妥鈉按1.5 mL/kg 腹腔注射麻醉，術區剃毛、消毒，頸正中切口暴露氣管，經口氣管插管，連接小動物呼吸機輔助通氣，于胸骨左緣剪開皮膚，鈍性分離肌肉，剪斷第2～4肋骨進胸，開瞼器撐開肋骨，打開心包并暴露升主動脈，用血管夾鉗夾主動脈根部，CME 組、NBP組及NBP + TAK-242組立即用注射器從心尖部將直徑42 μm微栓塞球混懸液0.1 mL注射至左心室，10 s后松開血管夾，Sham 組同法注射0.1 mL 生理鹽水。待心跳平穩后逐層關胸，待蘇醒后拔管脫機。大鼠術后6～12 h心功能明顯下降，心肌病理切片可見微栓塞提示CME模型制備成功。

1.3 心功能檢查 術后6 h 麻醉大鼠，超聲探頭頻率12 MHz，測量左心室射血分數（LVEF）、短軸縮短率（FS）、左心室舒張末徑（LVEDd）、左心室收縮末徑（LVEDs），連續測量3個心動周期，取平均值。

1.4 大鼠心肌組織病理學觀察及心肌微梗死面積的測量 術后6 h，行心臟彩超后，處死大鼠，取大鼠心底部組織，放入4%多聚甲醛固定液中浸泡，12 h后取出，石蠟包埋，切片，行HE染色，普通光學顯微鏡觀察大鼠心肌組織病理學改變。行HBFP染色，普通光學顯微鏡拍照，Image J v1.80測量心肌微梗死面積。

1.5 心肌組織TLR4 mRNA 檢測 采用RT-PCR法。心臟超聲檢查后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，沿原術口開胸取出心臟，預冷生理鹽水清洗，去除心耳、心房，心尖部用干冰冷凍后轉入-80 ℃冰箱保存。取心肌組織200 mg，按照TRIzol 試劑盒說明提取總RNA，并按照逆轉錄試劑盒說明將RNA 逆轉錄為cDNA。實驗的特異性引物由Sangon 公司合成：TLR4上游引物：5'-CTGCATAGAGGTAGTTCCT-3’；下游引物：5'-TCCAGCCACTGAAGTTCTGA-3’。GAPDH 上游引物：5'-TGTGAACGGATTTGGCCGTA-3’；下游引物：5'-GATGGTGATGGGTTTC-CCGT-3’。按試劑說明設置反應體系及參數，用SYBRGREENI 法檢測PCR 擴增產物，每個樣本均做3個復孔檢測，結果以2-ΔΔCT表示。

1.6 心肌組織TLR4 通路相關蛋白（TLR4、myD88、NF-κB）及炎性因子（IL-1β、TNF-α 蛋白）檢測 采用Western blotting法。取心肌組織加入RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑，組織研磨儀中研磨，4 ℃、12000 r/min 離心15 min，取上清液，用BCA法檢測蛋白濃度，將各組樣品濃度統一調至10 μg/μL。配制10% 的分離膠和5% 的濃縮膠，每孔加樣5 μL，恒壓60 V 電泳，Marker分層后調至110 V 進行電泳；恒流350 mA 60 min濕法將蛋白條帶轉至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，置于TLR4、myD88、NF-κB、IL-1β、TNF-α 的一抗溶液（1：1000）中，4 ℃下孵育過夜，次日TBST 洗膜后放置在相應1∶10000 熒光二抗室溫孵育1 h；TBST 洗膜后用化學發光液顯影，全能型成像系統掃膜；最后，用ImageJv1.80測量條帶灰度值。

1.7 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。采用Shapro-Wilk 檢驗數據是否符合正態分布，正態分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，使用Levene 檢驗進行方差齊性檢驗，當方差齊時，兩兩比較采用LSD-t檢驗，當方差不齊時，兩兩比較采用Tambane’sT2 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能指標比較 與Sham 組相比，其余各組LVEF 和FS 下降（P均＜0.01）；與CME 組相比，NBP 組 及NBP + TAK-242 組LVEF 和FS 升高（P均＜0.01）；與NBP 組 相 比，NBP + TAK-242組LVEF 和FS 升高（P均＜0.05）。與Sham 組相比，CME 組LVEDs 增加（P＜0.01）；與CME 組相比，NBP組及NBP + TAK-242 組LVEDd、LVEDs 降低（P均＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠心功能比較（±s）

表1 各組大鼠心功能比較（±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與CME組相比，△P＜0.05；與NBP組相比，#P＜0.05。

組別NBP + TAK-242組NBP組CME組Sham組LVEF（%）72.6 ± 2.4*△#68.9 ± 4.2*△56.4 ± 1.6*77.0 ± 2.1 FS（%）36.5 ± 2.2*△#33.5 ± 3.1*△25.4 ± 0.7*40.4 ± 2.2 LVEDd（mm）5.3 ± 0.55.1 ± 0.5△5.7 ± 0.45.4 ± 0.2 LVEDs（mm）3.4 ± 0.3△3.4 ± 0.3△4.2 ± 0.3*3.2 ± 0.1

2.2 各組大鼠心肌病理學表現及心肌微梗死面積 HE染色顯示Sham 組未見微栓塞球及心肌梗死灶；其余各組均可見血管內微栓塞球，微球周圍心肌細胞核溶解或消失，細胞水腫、變性，周圍可見白細胞浸潤和紅細胞滲出。與CME 組比較，NBP 組及NBP + TAK-242 組心肌細胞結構改變較輕，炎性細胞浸潤減少，見圖1。HBFP 染色結果顯示，Sham 組心肌組織未見明顯的微梗死灶，其余各組均可見血管內微栓塞球及周圍明顯的微梗死灶（梗死區顯紅色）。Sham 組、CME 組、NBP 組、NBP + TAK-242 組的微梗死面積占比分別為3.72% ± 0.51%、17.25% ± 1.74%、13.60% ± 1.59%、11.30% ±0.51%。與CME 組相比，NBP 組及NBP + TAK-242組的微梗死面積減小（P均＜0.01）；與NBP 組相比，NBP + TAK-242 組心肌微梗死面積進一步減小（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色結果（×100）

2.3 各組TLR4 mRNA 相對表達量比較 NBP +TLR4 組、NBP 組、CME 組、Sham 組的TLR4 mRNA 相對表達量分別為1.44 ± 0.21、1.67 ± 0.47、3.18 ±0.57、0.87 ± 0.28。 與Sham 組 相 比，CME 組TLR4 mRNA 相對表達量升高（P＜0.01）。與CME 組相比，NBP 組及NBP + TAK-242 組TLR4 mRNA 相對表達量降低（P均＜0.01）。與NBP 組相比，NBP +TAK-242 組TLR4 mRNA 相對表達 水 平降低（P＞0.05），但差異無統計學意義。

2.4 各組大鼠心肌TTLR4、MyD88、NF-κB 及炎性因子蛋白相對表達量比較 與Sham 組相比，CME組、NBP 組TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、TNF-α 蛋白相對表達量升高（P均＜0.05）。與CME 組相比，NBP 組及NBP + TAK-242 組TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、TNF- α蛋白相對表達量均降低（P均＜0.05）。與NBP 組相比，NBP + TAK-242 組TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α 蛋白相對表達量降低（P均＜0.05）；NBP + TAK-242 組NF-κB 蛋白相對表達量降低，但差異無統計學意義（P均＞0.05），見表2、圖2。

表2 各組大鼠心肌TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-1β相對表達量比較（±s）

表2 各組大鼠心肌TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-1β相對表達量比較（±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與CME組相比，△P＜0.05；與NBP組相比，#P＜0.05。

組別NBP + TAK-242組NBP組CME組Sham組TLR40.70 ± 0.28△#0.89 ± 0.20*△0.96 ± 0.22*0.77 ± 0.23 MyD880.64 ± 0.19△#0.87 ± 0.25*△1.08 ± 0.27*0.61 ± 0.11 NF-κB 0.70 ± 0.28△0.88 ± 0.27*△1.12 ± 0.31*0.58 ± 0.18 TNF-α 0.81 ± 0.16△#1.13 ± 0.20*△1.23 ± 0.27*0.77 ± 0.23 IL-1β 0.73 ± 0.16*△#0.97 ± 0.21*△1.05 ± 0.23*0.56 ± 0.18

圖2 各組大鼠心肌組織TLR4通路相關蛋白及炎性因子的電泳圖（Western blotting）

3 討論

研究顯示，CME 可導致心肌損傷及近、遠期心功能明顯下降，與急性ST 段抬高型心肌梗死患者PCI 治療后1年內心衰的病死率和住院率密切相關［3］。炎性因子參與CME 后心肌組織局部炎性反應，心肌炎癥反應與CME 后心肌收縮功能障礙密切相關［4-5］，抑制炎癥因子水平、減輕CME 后心肌炎癥反應可改善CME后心功能［12-13］。

NBP 有多種生物靶點，研究表明NBP 能減輕神經血管炎癥，保護神經功能［14-15］。BAI 等［6］研究發現，NBP 可抑制大鼠急性心肌梗死后IL-1β、TNF-α表達，減輕炎癥反應，抑制心肌細胞凋亡。QIU 等［16］發現在大鼠心力衰竭模型中，NBP 能抑制TNF-α 蛋白表達水平，保護心功能。在前期研究中，我們也發現NBP 預處理能減少CME 大鼠心肌IL-1β、TNF-α表達水平，減輕心肌炎癥反應，并改善CME 大鼠心功能［10］。

TLR4/MyD88/NF-κB 信號傳導通路與心肌炎癥反應、心肌細胞凋亡等密切相關［17］。SU 等［18］發現使用TLR4 特異性抑制劑TAK-242 可有效抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路激活，減輕CME 后心肌炎癥反應，改善心功能。另外，在大鼠CME 模型中，使用大蒜素、尼可地爾等同樣能抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活，減輕CME后心肌炎癥反應［19-20］，提示阻斷TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路可能成為減少CME 后心肌損傷的有效方法。本研究針對NBP 聯合TAK-242 能否增強抗炎效應，提高NBP保護CME所致心肌損傷的作用進行了研究。

本研究發現，CME 后6 h 大鼠心功能下降，心肌組織HE 染色可見血管內微梗塞球及周圍壞死心肌組織，白細胞浸潤明顯，心肌炎癥因子水平升高，而給予NBP 可明顯改善這種變化，與前期實驗結果基本一致。通過進一步檢測，我們發現CME 大鼠心肌組織TLR4 在mRNA 及蛋白水平的表達明顯升高，同時TLR4 調控的MyD88、NF-κB 蛋白水平均升高，提示CME 后TLR4 信號通路激活參與調控CME后大鼠心肌炎癥反應。給予NBP 后，大鼠心肌組織TLR4 mRNA 及蛋白水平的表達明顯降低，TLR4 調控的MyD88、NF-κB 蛋白及炎癥反應因子IL-1β、TNF-α水平均降低，提示NBP可能通過抑制TLR4表達，抑制TLR4信號通路激活，減輕CME 大鼠心肌炎癥反應。在NBP 聯合TAK-242 預處理后，CME 大鼠心肌TLR4 及下游通路蛋白水平進一步降低，心肌微梗死面積進一步減少，大鼠心功能進一步改善，說明NBP 聯合TAK-242 能協同抑制TLR4 通路激活，進一步減輕心肌炎癥反應，減輕心肌損傷，提高NBP單獨用藥對CME大鼠心肌損傷的保護作用。

綜上所述，NBP 聯合TAK-242 可能通過協同抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路信號激活，減輕CME 所致的心肌炎癥反應，從而減輕心肌損傷，改善心功能。NBP 聯合TAK-242 可能為防治CME 所致心肌損傷提供新的線索與方向。