毛細(xì)支氣管炎患兒血清IL-35、Th2類細(xì)胞因子水平變化及其意義

汪廉，孫明月，彭萬勝

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，安徽 蚌埠 233004

毛細(xì)支氣管炎是一種嬰幼兒常見的呼吸系統(tǒng)疾病，臨床上主要表現(xiàn)為喘息、氣促及三凹征等［1］，主要由呼吸道合胞病毒（RSV）感染引起。全球每年約有300 萬兒童因患毛細(xì)支氣管炎住院治療，其中有6～20萬兒童最終因其死亡［2］。毛細(xì)支氣管炎與免疫反應(yīng)密切相關(guān)，Th1/Th2 免疫失衡被認(rèn)為是毛細(xì)支氣管炎的主要發(fā)病機制，表現(xiàn)為免疫反應(yīng)向Th2 型反應(yīng)偏移，IL-4 等Th2 類炎癥性細(xì)胞因子的水平升高［3］。

有研究表明，IL-35可促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）的分泌，抑制Th2 類細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［4］。IL-35 是由Tregs 及多種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，為p35 與EBI3 亞基結(jié)合形成的異二聚體，屬于IL-12 家族［5-6］。IL-35 通過與T 細(xì)胞上的受體結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)，在炎癥性腸病、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎及過敏性氣道疾病等的發(fā)病過程中具有重要作用［7-9］。但目前國內(nèi)關(guān)于IL-35 與毛細(xì)支氣管炎關(guān)系的研究報道較少。本研究觀察了毛細(xì)支氣管炎患兒血清IL-35及Th2類細(xì)胞因子的水平變化，探討了血清IL-35及Th2 類細(xì)胞因子之間的關(guān)系，并分析了二者對毛細(xì)支氣管炎病情嚴(yán)重程度的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2019年12月—2021年3月收治的診斷為毛細(xì)支氣管炎的患兒68 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《毛細(xì)支氣管炎診斷、治療與預(yù)防專家共識（2014年版）》［1］中毛細(xì)支氣管炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天性氣道發(fā)育畸形、先天性心臟病、免疫缺陷病、哮喘等；②合并細(xì)菌感染；③合并全身多系統(tǒng)、器官的損害；④近期使用免疫調(diào)節(jié)藥物。根據(jù)《毛細(xì)支氣管炎診斷、治療與預(yù)防專家共識（2014年版）》［1］，將患兒分為輕度組34例及中重度組34例，對照組選取我院兒科康復(fù)病房同期同年齡，近期無呼吸道感染臨床癥狀，無其他系統(tǒng)感染史的兒童（診斷為發(fā)育指標(biāo)延遲、全面性發(fā)育落后等的兒童）。由于中、重度毛細(xì)支氣管炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)較為接近，且中、重度組病例數(shù)相對輕度組少，故將其合并為一組。觀察組年齡中位數(shù)為7 個月，對照組年齡中位數(shù)為11個月，兩組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。輕度組年齡中位數(shù)為6 個月，入院時的病程中位數(shù)為4 天，中重度組年齡中位數(shù)為8.5個月，入院時的病程中位數(shù)為3.5天，兩組年齡、入院時的病程差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬知情同意。

1.2 血清IL-35、Th2 類細(xì)胞因子的檢測 患兒入院24 h 內(nèi)，抽取空腹外周靜脈血，靜置半小時后，以3000 r/min 離心10 min，離心半徑為10 cm，將血清分裝在凍存管內(nèi)，做好標(biāo)記放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肊LISA 法檢測血清中的IL-35 及Th2 類細(xì)胞因子，IL-35 試劑盒由Elabscience 公司生產(chǎn)，各Th2 類細(xì)胞因子試劑盒均由ABclonal 公司生產(chǎn)，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，反應(yīng)終止后在ELISA 檢測儀上，于450 nm 波長下，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD 值，用ELISA 數(shù)據(jù)分析軟件計算對應(yīng)樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk 檢驗進(jìn)行正態(tài)性檢驗，并進(jìn)行方差齊性分析，如果數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，用±s表示，比較采用t檢驗；如果數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，用M（P25，P75）表示，比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。細(xì)胞因子間相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)。影響因素分析采用多元線性回歸。診斷效能分析采用ROC。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 水平比較 觀察組血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 水平 分 別 為10.55（9.00，12.11）、（7.73 ± 1.39）、（129.15 ± 17.80）、（741.00 ± 109.87）、31.21（24.92，38.38） pg/mL，對 照 組 分 別 為14.34（12.48，16.81）、（5.46 ± 1.17）、（158.58 ± 17.14）、（569.12 ±96.91）、52.92（45.18，60.45）pg/mL。與對照組比較，觀察組血清IL-35、IL-10、IL-33 水平低，IL-4、IL-13水平高（P均＜0.01）。

中重度組血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 水平 分 別 為（9.65 ± 1.74）、8.45（7.49，9.71）、（121.49 ± 17.26、（788.00 ± 95.80）、（29.21 ±7.75）pg/mL，輕度組分別為（11.52 ± 1.90）、6.93（6.29，7.45）、（136.80 ± 14.99）、（694.00 ± 103.81）、（34.09 ± 8.63）pg/mL。與輕度組比較，中重度組血清IL-35、IL-10、IL-33 水平低（P均＜0.05），IL-4、IL-13水平高（P均＜0.01）。

2.2 觀察組血清IL-35與TH2類細(xì)胞因子之間及二者與病情之間的關(guān)系 血清IL-35與IL-10呈正相關(guān)（rs=0.291，P＜0.05），與IL-4 呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.251，P＜0.05）。

以中重度毛細(xì)支氣管炎為因變量（是=1，否=0），以IL-4、IL-10、IL-13、IL-33、IL-35為自變量（均以實際值賦值）進(jìn)行回歸分析。結(jié)果顯示，IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 是疾病嚴(yán)重程度的影響因素（P均＜0.05）。見表1。

表1 觀察組疾病嚴(yán)重程度的多元線性回歸分析結(jié)果

2.3 血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 對中重度毛細(xì)支氣管炎的診斷效能 IL-35 的診斷界值為10.53 pg/mL，曲線下面積（AUC）為0.760（95%CI：0.641～0.855，P＜0.001），靈敏度為70.6%，特異度為70.6%；IL-4 的診斷界值為7.3 pg/mL，AUC 為0.827（95%CI：0.716～0.908，P＜0.001），靈敏度為82.4%，特異度為73.5%；IL-10 的診斷界值為115.38 pg/mL，AUC 為0.712（95%CI： 0.589～0.815，P＜0.001），靈 敏 度 為44.1%，特 異 度 為97.1%；IL-13 的 診 斷 界 值 為643 pg/mL，AUC 為0.739（95%CI：0.618～0.838，P＜0.001），靈敏度為97.1%，特異度為41.2%；IL-33 的診斷界值為22.61 pg/mL，AUC 為0.635 （95%CI： 0.509～0.748，P＜0.05），靈 敏 度 為26.5%，特 異 度 為100.0%，詳見圖1。

圖1 血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33診斷中重度毛細(xì)支氣管炎的ROC

3 討論

隨著近年來毛細(xì)支氣管炎發(fā)病率的上升，疾病免疫學(xué)方面的研究逐漸增多。研究認(rèn)為，毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病過程與免疫反應(yīng)密切相關(guān)，Th1/Th2 免疫失衡是毛細(xì)支氣管炎的主要發(fā)病機制之一，主要表現(xiàn)為Th2 型免疫反應(yīng)增強，Th1 型免疫反應(yīng)減弱［3］。針對相關(guān)細(xì)胞因子的研究對診斷及治療毛細(xì)支氣管炎具有重要意義。

IL-35 主要由Tregs 細(xì)胞產(chǎn)生，IL-35 在T 細(xì)胞上有3 種受體，包括IL-12Rβ2同型二聚體、gp130 同型二聚體及IL-12Rβ2/gp130 異二聚體，IL-35 通過與T細(xì)胞上的受體結(jié)合，激活JAK1、JAK2、STAT1 及STAT4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［6］。IL-35 可通過抑制細(xì)胞分裂G1期向S 期分化，抑制CD4+、CD8+T 細(xì)胞（Th1、Th17 等）的增殖，抑制Th1 類細(xì)胞因子及IL-17A 的分泌［10］；可通過抑制GATA3 和IL-4的表達(dá)，抑制Th2 的增殖，抑制Th2 型免疫反應(yīng)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)支氣管炎患兒血清IL-35 水平低，且中重度患兒較輕度患兒更明顯，提示IL-35在毛細(xì)支氣管炎中可能具有保護(hù)作用。通過研究細(xì)胞因子間相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，IL-35與IL-10呈正相關(guān)，與IL-4呈正相關(guān)。ROC顯示，IL-35對中重度毛細(xì)支氣管炎具有較高的診斷效能，提示IL-35可用于輔助判斷毛細(xì)支氣管炎的嚴(yán)重程度。FAN 等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，RSV 感染組患兒IL-35的水平較健康對照組升高。IL-35的水平變化存在爭議。有證據(jù)表明，IL-10在RSV感染不同階段中的表達(dá)有差異［13］，且IL-35 與IL-10 存在相關(guān)性［12］，因此，IL-35 可能存在類似的變化。廖廷彥等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，RSV 感染的毛細(xì)支氣管炎患兒入院后第2 天血清IL-35 的水平低于對照組，本研究的結(jié)果與其一致，說明IL-35 在RSV 感染不同階段中的表達(dá)存在差異，可能是不同研究中IL-35水平差異產(chǎn)生的原因。

Th2 類細(xì)胞因子IL-4 是Th2 型免疫反應(yīng)的特征性細(xì)胞因子，可抑制Th1 類細(xì)胞因子IFN-γ 的活性［3］。IL-10 由CD4+及CD8+T 細(xì)胞產(chǎn)生，參與RSV激活的免疫細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子和趨化因子的調(diào)節(jié)。在毛細(xì)支氣管炎中，IL-10缺乏可引起疾病嚴(yán)重程度增加，恢復(fù)延遲［13］。IL-13在哮喘的發(fā)病過程中具有重要作用，可促進(jìn)IgE 的產(chǎn)生［15］。在呼吸道疾病中，IL-33 是哮喘等過敏性氣道疾病的重要介質(zhì)。IL-33 主要由組織細(xì)胞表達(dá)，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，在炎癥感染時可由肥大細(xì)胞及樹突樣細(xì)胞表達(dá)［16］。IL-33 受體包括ST2 蛋白及IL-1 受體輔助蛋白，IL-33 與受體結(jié)合，通過MyD88、MAPK 及NF-κB 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，參與機體的先天性免疫及適應(yīng)性免疫［15-16］。當(dāng)感染或組織損傷時，IL-33從壞死的細(xì)胞核釋放到細(xì)胞外，促使2 型先天性淋巴細(xì)胞（ILC2s）刺激Th2類細(xì)胞因子IL-5、IL-13的分泌，免疫反應(yīng)向Th2 偏移［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)支氣管炎患兒血清IL-4、IL-13 水平高，IL-10、IL-33 水平低，且中重度患兒較輕度患兒更明顯。多元回歸分析顯示IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 均是疾病嚴(yán)重程度的影響因素，提示Th2 類細(xì)胞因子與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。ROC 顯示，IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 對中重度毛細(xì)支氣管炎均具有較高的診斷效能，提示Th2類細(xì)胞因子可用于輔助判斷毛細(xì)支氣管炎的嚴(yán)重程度。FAN等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，RSV感染組患兒IL-10的水平較健康對照組顯著升高，中重度患兒血清IL-10的水平較輕度患兒顯著降低。GAO 等［19］通過小鼠模型發(fā)現(xiàn)，RSV 感染小鼠的外周血Tregs 及IL-10 的水平低于健康小鼠。IL-10 的水平變化存在爭議。SUN 等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，在RSV 感染后的24 h 內(nèi)，小鼠表現(xiàn)為細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)增加，此時，IL-10 未誘導(dǎo)Th2 類細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而在感染后的8～10 天，小鼠表現(xiàn)為Th2 類細(xì)胞因子的表達(dá)增加。在RSV 感染后的第6 天，IL-10 呈高表達(dá)，在第8 天，IL-10 的水平逐漸降低。因此，IL-10 在RSV 感染不同階段中的表達(dá)差異可能是不同研究中IL-10 水平差異產(chǎn)生的原因。VU 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，中重度RSV感染患兒的鼻咽分泌物IL-4、IL-13、IL-33 及ILC2s的水平較輕度患兒顯著升高，多元回歸分析顯示IL-4（OR=9.67，95%CI：2.45～38.15，P=0.001）是疾病嚴(yán)重程度的影響因素。CHRISTIAANSEN 等［3］的研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)RSV 感染患兒Th1 及Th2 類細(xì)胞因子的水平升高，但I(xiàn)L-33 及Tregs 的水平降低。IL-33 的水平變化存在爭議。CHRISTIAANSEN 等［3］認(rèn)為，RSV感染時細(xì)胞凋亡而非壞死可能是IL-33水平變化的原因，IL-33 的降低使Tregs 募集減少，引起Tregs的水平降低，但該推論仍有待進(jìn)一步證實。

綜上所述，毛細(xì)支氣管炎患兒血清IL-35、IL-10、IL-33 水平低，IL-4、IL-13 水平高，且中重度患兒較輕度患兒更明顯。血清IL-35水平與IL-10呈正相關(guān)，與IL-4 呈負(fù)相關(guān)。Th2 類細(xì)胞因子是毛細(xì)支氣管炎疾病嚴(yán)重程度的影響因素。IL-35 及Th2 類細(xì)胞因子可用于輔助判斷毛細(xì)支氣管炎的嚴(yán)重程度。隨著對毛細(xì)支氣管炎發(fā)病機制的研究，免疫治療的重要性越發(fā)突出，針對相關(guān)細(xì)胞因子開發(fā)潛在的免疫治療藥物，對緩解毛細(xì)支氣管炎的癥狀，縮短病程具有重要意義。本研究在設(shè)計上仍然存在一些缺陷。例如：患兒病原體的檢出率較低，未能對引起毛細(xì)支氣管炎的病原體進(jìn)行具體劃分，無法驗證不同病原體對細(xì)胞因子水平的影響；患兒的年齡范圍較廣，未再進(jìn)行準(zhǔn)確分類，無法驗證年齡對細(xì)胞因子水平的影響；針對患兒血清進(jìn)行研究較呼吸道分泌物準(zhǔn)確性差。以上均有可能對研究結(jié)果產(chǎn)生影響。下一步研究將篩選RSV 感染的毛細(xì)支氣管炎患兒，觀察疾病不同階段血清IL-35 及Th2 類細(xì)胞因子的變化，探討IL-35及Th2類細(xì)胞因子在疾病各階段的作用。