富氫液腹腔注射對心肌缺血/再灌注大鼠急性肺損傷的預防作用及其機制

王樹志，李麗華，付乃寬

天津市胸科醫院，天津市心血管病研究所心功能科，天津 300222

心肌缺血/再灌注損傷是急性冠脈綜合征、心外科手術、經皮冠狀動脈介入術、心肺復蘇等臨床治療中常見并發癥。心肌缺血/再灌注損傷時過度炎性反應釋放大量炎性因子，可經循環系統轉運至其他重要臟器［1］。遷移的炎性因子可誘導大量中性粒細胞活化聚集并浸潤肺組織，進一步釋放大量炎性因子，產生炎癥級聯反應，表現為肺上皮細胞損傷、毛細血管通透性改變及肺水腫等［2-3］。氫氣作為自然界最小的分子，具有明顯的抗氧化、抗炎及抗凋亡作用［4］。研究表明，2% 氫氣吸入可通過抑制炎癥反應和氧化應激來減輕膿毒癥小鼠肺損傷［5］。血紅素氧合酶-1（HO-1）是一種內源性保護蛋白，其具有明顯的抗氧化、抗炎及抑制細胞凋亡等作用［6］。研究發現，氫氣治療可通過上調HO-1抑制炎癥反應來減輕膿毒癥小鼠肺損傷［7］。然而，目前尚無富氫液對心肌缺血/再灌注大鼠急性肺損傷影響的研究。2019年6—12月，我們在大鼠心肌缺血/再灌注急性肺損傷前給予富氫液，觀察大鼠肺損傷程度以明確富氫液是否具有預防肺損傷作用，同時檢測炎性因子以及HO-1，以探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 成年雄性SD 大鼠（220～250 g，中國軍事醫學科學院實驗動物中心。主要試劑：鋅原卟啉（ZnPPIX，Sigma 公司，美國），ELISA 試劑盒（Elabscience 公司，武漢），蛋白定量試劑盒（Bio-Rad公司，美國），蘇木素染液（邁新生物有限公司，福州），一抗鼠單抗HO-1（Abcam 公司，英國），兔單抗β-actin（華安公司，杭州），羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗（中杉金橋生物有限公司，北京）。主要儀器：DW-2000 型動物呼吸機（嘉鵬科技有限公司，上海），生物機能實驗系統（泰盟軟件有限公司，成都），GCH-500 型高純氫氣發生器（同普分析儀器科技有限公司，天津），MK3 酶標儀（Thermo 公司，美國），光學顯微鏡（Olympus 公司，日本），Gel-pro 圖像分析系統（Media Cybernetics公司，美國）。

1.2 大鼠分組、心肌缺血/再灌注模型建立及富氫液腹腔注射 SD 大鼠按隨機數字表法分為心肌缺血/再灌注+ 富氫液+ HO-1 抑制劑組（抑制劑組）、心肌缺血/再灌注+ 富氫液組（HS組）、心肌缺血/再灌注組（I/R組）和假手術組（S組）各18例。

采用冠脈結扎術建立心肌缺血/再灌注急性肺損傷模型［8］，腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠后，氣管插管行機械通氣，皮下電極監測Ⅱ導聯心電圖。大鼠開胸后置于手術臺穩定10 min，以利于大鼠適應，于左鎖骨中線處切開胸壁，分離左前降支并穿線，穩定10 min后結扎其30 min，松開結扎線再灌注120 min，左前降支結扎成功的標準：心前區變白，心電圖ST 段弓背向上抬高（＞0.12 mV），再灌注成功標準：ST段下降1/2以上，心尖復紅。

抑制組大鼠在冠狀動脈結扎術前30 min腹腔注射鋅原卟啉（25 mg/kg），于再灌注前5 min腹腔注射富氫液10 mL/kg［9］（使用GCH-500 高純氫氣發生器制備氫氣，將生理鹽水置于高純氫氣環境中，在0.4 MPa 壓力下暴露4 h，至氫飽和狀態，γ 射線消毒滅菌。富氫液含氫濃度為0.6 mmol/L）。HS組大鼠于再灌注前5 min 腹腔注射富氫液10 mL/kg。I/R 組大鼠分離左冠狀動脈前降支并結扎30 min 后，松開結扎線再灌注120 min。S組大鼠僅穿線不結扎。心肌缺血/再灌注誘導急性肺損傷模型制備成功的標準：BALF、肺濕/干重比增加：肺血管通透性和肺水腫程度增加；肺組織病理學檢查：肺細胞結構紊亂，肺間質和肺泡水腫，肺泡內及肺泡壁充血、實變，肺間質滲出嚴重。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 大鼠BALF 總蛋白檢測 再灌注2 h 時，取上述大鼠麻醉后，用0.5 mL PBS灌洗右側肺，重復3次，收集灌洗液，4 ℃下1500×g 離心15 min，取上清液，采用蛋白定量試劑盒測定大鼠BALF總蛋白。

1.3.2 大鼠肺組織病理評分測算 再灌注2 h，取上述大鼠左肺組織，甲醛固定6 h，石蠟包埋切片后，行蘇木素—伊紅（HE）染色，光學顯微鏡（×40）下觀察肺組織病理改變，評分包括肺組織水腫、充血、中性粒細胞遷移和浸潤、肺泡內出血、實變及增生情況，每項評分按損傷程度分為0、1、2和3分，取各項評分總和。

1.3.3 大鼠肺組織濕/干重比檢測 再灌注2 h時，每組取6只大鼠，麻醉后取左肺組織，生理鹽水充分漂洗，濾紙吸干多余水分，稱濕重，恒溫干燥箱80 ℃烘烤24 h稱干重，計算肺組織濕/干重比值（W/D）。

1.3.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10 檢測 再灌注2 h時，每組取6只大鼠，采集下腔靜脈血樣2 mL，4 ℃下3000×g 離心15 min，取血清。參照ELISA 試劑盒檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-10。

1.3.5 大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-10 和HO-1 檢測 再灌注2 h 時，取上述大鼠右肺組織，勻漿后，4 ℃下10000×g 離心15 min，取上清液。參照ELISA試劑盒檢測大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-10和HO-1。

1.3.6 大鼠肺組織HO-1 蛋白檢測 采用Westerm blotting 法。再灌注2 h 時，每組取6 只大鼠，麻醉后取左肺組織并稱重，加入含蛋白酶抑制劑RIPA 裂解液，勻漿，4 ℃下14000 r∕min離心15 min，取上清為總蛋白。BCA 法蛋白定量后保存于-80 ℃冰箱備用。 取50 μg 蛋白樣品，加入4×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，然后進行凝膠電泳1 h，轉膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入一抗鼠單抗HO-1（稀釋度1∶1000）和兔單抗β-actin（稀釋度1∶1000），4 ℃孵育過夜，TBST清洗5次×5 min，加入羊抗小鼠二抗（稀釋度l∶2000）或羊抗兔二抗（稀釋度1∶2000），室溫孵育1 h，ECL 顯影，采用Gel-pro 圖像分析軟件測定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin 灰度值的比值來反映目的蛋白的表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件。正態性分布檢驗采用shapiro-Wilk法，符合正態分布的計量資料以xˉ± s 表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠BALF 總蛋白含量、肺組織病理評分及肺W/D 比較 與S 組相比，I/R 組、HS 組、抑制劑組大鼠BALF 總蛋白含量、肺組織病理評分及肺W/D 均高（P均＜0.05），提示肺組織出現損傷。與I/R組相比，HS組大鼠BALF總蛋白含量、肺組織病理評分和肺W/D 均低（P均＜0.05）。與HS 組相比，抑制劑組大鼠BALF 總蛋白含量、肺組織病理評分及肺W/D均高（P均＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠肺組織BALF總蛋白含量、肺組織病理評分、W/D比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織BALF總蛋白含量、肺組織病理評分、W/D比較（±s）

注：與S 組比較，aP ＜0.05；與I/R 組比較，bP ＜0.05；與HS 組比較，cP＜0.05。

組別抑制劑組HS組I/R組S組BALF總蛋白（mg/mL）5.13 ± 0.82ac 2.67 ± 0.52ab 6.16 ± 0.68a 0.42 ± 0.08肺組織病理評分（分）8.67 ± 1.24ac 4.54 ± 1.32ab 9.85 ± 1.57a 0.62 ± 0.36 W/D 5.82 ± 0.67ac 4.26 ± 0.56ab 6.52 ± 0.53a 3.14 ± 0.26

2.2 各組大鼠血清和肺組織TNF-α、IL-1β及IL-10水平比較 與S組相比，I/R組、HS組、抑制劑組大鼠血清和肺組織TNF-α、IL-1β和IL-10水平均高（P均＜0.05）。與I/R組相比，HS組大鼠血清和肺組織TNF-α、IL-1β水平均低，IL-10水平高（P均＜0.05）。與HS組相比，抑制劑組大鼠血清和肺組織TNF-α、IL-1β水平均高，IL-10水平低（P均＜0.05），見表2、表3。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較（±s）

注：與S組比較，aP＜0.05；與I/R組比較，bP＜0.05；與HS組比較，cP＜0.05。

組別抑制劑組HS組I/R組S組TNF-α（pg/mL）289.56 ± 33.59ac 186.73 ± 24.53ab 335.15 ± 32.87a 15.36 ± 1.85 IL-1β（pg/mL）315.57 ± 34.63ac 201.72 ± 6.91ab 365.63 ± 38.28a 19.62 ± 1.94 IL-10（pg/mL）33.36 ± 8.23ac 62.95 ± 7.56ab 30.56 ± 4.27a 16.62 ± 1.34

表3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較（±s）

注：與S組比較，aP＜0.05；與I/R組比較，bP＜0.05；與HS組比較，cP＜0.05。

組別抑制劑組HS組I/R組S組TNF-α（pg/mg·prot）573.43 ± 38.62ac 313.37 ± 36.56ab 626.86 ± 45.48a 19.45 ± 2.04 IL-1β（pg/mg·prot）603.33 ± 42.86ac 336.26 ± 32.84ab 653.35 ± 48.54a 26.36 ± 3.45 IL-10（pg/mg·prot）47.36 ± 4.12ac 95.39 ± 5.52ab 45.74 ± 4.35a 13.34 ± 1.25

2.3 各組大鼠肺組織HO-1 水平比較 與S 組相比，I/R組、HS組、抑制劑組大鼠肺組織HO-1蛋白濃度和水平均高（P均＜0.05）。與I/R組相比，HS組大鼠肺組織HO-1 蛋白濃度和水平均高（P均＜0.05）。與HS 組相比，抑制劑組大鼠肺組織HO-1 蛋白濃度和水平低（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠肺組織HO-1蛋白水平比較（±s）

表4 各組大鼠肺組織HO-1蛋白水平比較（±s）

注：與S組比較，aP＜0.05；與I/R組比較，bP＜0.05；與HS組比較，cP＜0.05。

組別抑制劑組HS組I/R組S組HO-1蛋白（pmol/mg）9.3 ± 2.1ac 19.6 ± 4.5ab 9.8 ± 1.8a 4.5 ± 0.9 HO-1蛋白1.64 ± 0.13ac 1.96 ± 0.18ab 1.65 ± 0.16a 1.00 ± 0.00

3 討論

冠脈結扎術是建立心肌缺血/再灌注損傷的經典模型。心肌缺血/再灌注時造成心肌損傷的同時可激活機體發生炎性反應并釋放大量炎性因子，炎性因子經循環系統作用于相鄰和遠端臟器［3］。急性肺損傷是指各種因素導致的彌漫性肺間質和肺泡水腫，主要表現為肺順應性降低、滲出性病變等。本研究發現心肌缺血/再灌注后大鼠支氣管肺泡灌洗液總蛋白濃度高，肺W/D 高，表明肺血管通透性和肺水腫程度增加；同時肺組織病理學檢查顯示肺細胞結構紊亂，肺間質和肺泡水腫，肺泡內及肺泡壁充血、實變，肺間質滲出嚴重，可見大量炎性細胞浸潤，表明大鼠心肌缺血/再灌注后發生了急性肺損傷。

缺血/再灌注早期，炎癥因子經循環系統至肺組織，可誘導大量中性粒細胞聚集，發生炎癥級聯反應，還可激活肺組織發生氧化應激，導致肺上皮細胞損傷、肺毛細血管通透性增加、肺水腫等。因此，調控炎癥介質的釋放是改善心肌缺血/再灌注后自身和遠隔臟器損傷的關鍵因素。炎性反應中，不同炎性因子可發揮不同作用：促炎因子TNF-α、IL-1β 等可促進炎性反應的發展，放大炎性效應；抗炎因子IL-10 等則能抑制炎性細胞的活性，減輕炎性反應。本研究結果表明心肌缺血/再灌注后，I/R 組大鼠血清和肺組織促炎因子TNF-α和IL-1β含量明顯增高，與肺組織損傷表現一致，而血清和肺組織抗炎因子IL-10也部分增高，表明心肌缺血/再灌注同時激活了肺組織的促炎和抗炎反應，并與肺組織損傷密切相關。

氫氣作為一種新型的醫療作用氣體分子，具有抗氧化應激、抗炎、抗凋亡以及調控基因表達和信號通路等作用，其已被證實對多種疾病具有防治作用。 研究發現，富氫液可通過抑制TLR4/MyD88 信號通路來降低肺組織TNF-α、IL-1β 等炎性因子水平，改善大鼠內毒素性急性肺損傷。本研究發現于心肌缺血/再灌注后，給予富氫液處理組大鼠血清和肺組織促炎因子TNF-α、IL-1β 含量明顯降低，抗炎因子IL-10 明顯增高，肺組織損傷明顯減輕，表明富氫液可抑制心肌缺血/再灌注誘發的肺組織炎性反應，并促進抗炎反應。

HO 是機體對抗損傷、細胞應激、炎癥等傷害性刺激的重要保護系統。HO-1 能催化血紅素代謝生成膽綠素、鐵和一氧化碳，這些代謝產物均有抑制氧化應激和炎癥反應的作用。研究表明氫氣治療可通過上調HO-l來抑制炎癥反應，進而減輕膿毒癥小鼠肺損傷，而給予HO-1 抑制劑ZnPPIX 后可部分逆轉氫氣對膿毒癥肺損傷的保護作用［7］。此外，腹腔注射ZnPPIX（25 mg/kg）也可明顯抑制脂聯素對膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用。本研究發現給予富氫液處理后，心肌缺血/再灌注大鼠肺組織HO-1 蛋白濃度和水平均明顯提高，炎癥水平明顯降低，抗炎水平提高；而給予HO-1 抑制劑ZnPPIX 后，肺組織HO-1蛋白濃度和水平均顯著減低，炎癥水平又明顯升高，抗炎水平降低，表明富氫液可減輕心肌缺血/再灌注大鼠肺組織炎癥，并與上調HO-1有關。

綜上所述，富氫液處理可明顯減輕心肌缺血/再灌注大鼠肺組織損傷，其機制可能與上調HO-1減輕肺組織炎性反應有關。因此，富氫液可能是預防心肌缺血/再灌注誘導急性肺損傷的一種有效措施。