HPLC法測定冠心寧注射液中依地酸二鈉的含量

宋娜娜，李響明*，周永妍，張睿智，丁艷譜，楊 琴，孫勝斌，3，姜國志，3

(1.神威藥業集團有限公司，河北 石家莊 051430；2.河北省中藥注射液工程技術研究中心，河北 石家莊 051430；3.中藥注射劑新藥技術開發國家地方聯合工程實驗室，河北 石家莊 051430)

冠心寧注射液為黃棕色至棕紅色的澄明液體，為供臨床靜脈滴注的濃溶液，由丹參、川芎水提精制而成的滅菌水溶液[1]。具有活血化瘀、通脈養心的功效，用于冠心病心絞痛的治療。現代藥理研究表明，冠心寧注射液具有擴張冠狀動脈，促進冠脈側支循環，增加冠脈血流量，降低心肌耗氧量，耐缺氧，增加心肌收縮力，減慢心率，改善心臟功能，改善心肌缺血，改善微循環、抑制血液凝固、促進纖溶、改善血流變的作用[2-3]，臨床應用越來越廣泛。

中藥制劑化學成分復雜，含有一定量的金屬離子，在金屬離子的催化作用下可發生一系列化學反應，從而影響制劑的穩定性。因此，在冠心寧注射液生產中常添加金屬絡合劑依地酸二鈉，以減緩金屬離子的影響，維持制劑的穩定。冠心寧注射液的使用方式為靜脈滴注，臨床風險相對較大，因此對添加的輔料要求較高。目前未見針對冠心寧注射液中依地酸二鈉含量的檢測項目及檢測方法的文獻報道。為全面真實地反映生產企業輔料的用量，探索貯存期內輔料的變化規律，切實保障廣大患者的用藥安全，有必要研究開發一種適用于冠心寧注射液中依地酸二鈉含量的測定方法。

中國藥典測定硫代硫酸鈉含量的方法有碘量法[4]、滴定法[5]，滴定液的配制和標定要求嚴格，且耗時較長。而中藥注射液自身顏色較重，對以顏色變化判斷滴定終點的方法有干擾；再者中藥注射劑中除已知成分和輔料外，還有很多未知成分，增加了準確測定的難度。因此，本研究建立了測定冠心寧注射液中依地酸二鈉含量的高效液相色譜法，該方法專屬性強、靈敏度高、操作簡便、結果準確，可用于冠心寧注射液中輔料的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，QuatPump泵，DAD檢測器，全自動進樣器，Agilent OpenLAB 2.3色譜工作站。

1.2 試劑及試藥

二水合乙二胺四乙酸二鈉(分析純，南京化學試劑股份有限公司生產)；40%四丁基氫氧化銨溶液(薩恩化學試劑股份有公司)；三氯化鐵(分析純，南京化學試劑股份有限公司生產)；甲酸(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)；水為純化水。冠心寧注射液由神威藥業集團有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

XB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，Serial No.6042312(Shimadzu，Inc.)；C18保護柱(5 μm，10 mm×4.6 mm，Alltech)。流動相含3.0%甲醇和0.1%甲酸的水溶液(用40%四丁基氫氧化銨溶液調pH=3.5)；檢測波長：258 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：40 ℃。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取二水合乙二胺四乙酸二鈉對照品27.54 mg置25 mL棕色容量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液5 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加入10 mg/mL三氯化鐵溶液0.3 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密吸取冠心寧注射液4 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，精密加入10 mg/mL三氯化鐵溶液0.3 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

按處方制備缺依地酸二鈉陰性制劑，按“2.3”項下的方法制備，即得。

2.5 專屬性

分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液注入液相色譜儀，按“2.1”項下方法測定，結果顯示陰性對照無干擾，說明該方法專屬性較強。見圖1。

圖1 陰性樣品溶液與供試品溶液色譜

2.6 線性

分別精密吸取對照品溶液0.4、0.6、1.0、1.6、1.8、2.0 mL置2 mL棕色量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，制成20.00、30.00、50.00、80.00、90.00、100.00 μg/mL的對照品溶液，以各對照品濃度(μg/mL)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=24.405x-71.264，r=0.999 9。表明依地酸二鈉在20.00～100.00 μg/mL范圍內線性關系良好。

圖2 依地酸二鈉標準曲線

2.7 穩定性考察

分別取對照品溶液和冠心寧注射液(180715A2)按“2.3”項下方法處理，分別于0、2、4、8、12、24 h時連續測定，結果表明對照品溶液與供試品溶液各峰峰面積的RSD分別為0.53%、1.05%，均<2%，說明對照品與供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 精密度試驗

2.8.1 進樣精密度 取對照品溶液連續進樣5次，依法測定，計算對照品峰面積的RSD為0.54%，<2.0%。

2.8.2 重復性試驗 平行取批號為180715A2的冠心寧注射劑6份，按“2.3”項下方法制成6份供試品溶液，每份進樣1次，連續測定，根據外標一點法計算得依地酸二鈉平均含量為0.129 1 mg/mL，RSD為2.57%，說明該方法重復性良好。見表1。

表1 依地酸二鈉含量測定重復性試驗

2.8.3 中間精密度 由另一名分析人員在不同日期按重復性試驗項下方法重新配制6份供試品溶液，進樣測定，將測定結果與重復性試驗結果進行比較，共12份樣品的測定結果表明，兩組12次測定結果RSD均<5.0%，說明該方法精密度良好。見表2。

表2 依地酸二鈉含量測定中間精密度試驗

2.9 加樣回收試驗

精密量取冠心寧注射液2.0 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加入0.099 5 mg/mL的乙二胺四乙酸二鈉對照品溶液2.6 mL，再加入10 mg/mL的三氯化鐵溶液0.3 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min濾過，共平行操作6份。根據外標一點法計算總含量，再減去注射液樣品中依地酸二鈉含量，其差值除以加入的相應對照品含量，得回收率。計算所得的平均回收率(%)及RSD(%)見表3。

表3 依地酸二鈉含量測定加樣回收試驗

2.10 檢測限與定量限

選擇適宜濃度的對照品溶液進樣，使得信噪比為3∶1，計算對照品的進樣量，即得檢測限；信噪比為10∶1時，計算對照品的進樣量，即得定量限。依地酸二鈉的檢測限為0.54 ng，定量限為1.6 ng。

2.11 耐用性

分別考察不同色譜柱(XB-C18、Kromasil C18、Phenomenex Gemini-C18)、不同柱溫(20、25、30 ℃)、不同流速(0.8、0.9、1.0 mL·min-1)、不同pH值(3.0、3.5、4.0)以及不同濃度甲酸溶液(0.1%、0.13%、0.15%)的流動相，結果發現隨上述色譜條件的改變，各色譜峰的分離度變化不大，說明該方法的耐用性較好。

2.12 注射液中依地酸二鈉的含量測定

精密量取每批冠心寧注射液4.0 mL，按“2.3”項下方法處理，平行2次，根據外標一點法計算依地酸二鈉含量。見表4。

表4 10批注射液中依地酸二鈉的含量測定

3 討論

目前測定依地酸二鈉含量的研究或質量標準中多采用滴定法和比色法。但這兩種方法很難分辨依地酸二鈉螯合物和其他物質形成的螯合物，專屬性相對較差，對測定結果有干擾，故本研究考慮采用專屬性較高的HPLC法[6-8]。HPLC法測定含量是通過檢測依地酸二鈉的金屬螯合物來實現定量的。

依地酸二鈉可與色譜柱的不銹鋼表面發生作用，致使依地酸二鈉的響應值低，且峰形嚴重拖尾，依地酸二鈉易與金屬離子螯合形成穩定的水溶性螯合物。綜上，本研究首選使其與金屬離子形成螯合物再測定含量，不僅成功避免了依地酸二鈉對色譜柱的損害，還提高了檢測靈敏度，改善了峰形。有研究指出依地酸二鈉與三價鐵離子形成的螯合物穩定系數較高[7]，故本研究采用硫酸鐵溶液、三氯化鐵溶液與依地酸二鈉和鐵離子形成穩定的螯合物，且該螯合物具有穩定的紫外吸收，在258 nm處有最大吸收。目前采用高效液相色譜法測定注射劑中依地酸二鈉含量的研究，多為化藥制劑[9-11]，關于中藥注射液產品中該輔料的報道不多。本研究所用方法可以準確測定冠心寧注射液中依地酸二鈉的含量，可作為評價該輔料投料準確性的一種技術手段，也為進一步探索該輔料在有效期內的變化規律提供了參考依據，為該產品的輔料控制研究提供了實驗基礎。

本研究通過全面的方法學驗證，建立了可靠、高效、專屬性強的測定冠心寧注射液中輔料依地酸二鈉含量的高效液相色譜法，為冠心寧注射液的全面質量控制提供了參考依據，同時也為其他含依地酸二鈉制劑的質量控制研究提供了思路。