黃芪超微粉對環磷酰胺致免疫失衡小鼠免疫功能的影響

寇卜心，柴夢音，豆雙雙，劉曉霓*

(1.首都醫科大學附屬北京佑安醫院，北京 100069；2.北京市肝病研究所，北京 100069)

超微粉碎技術是一種新型物料加工物理技術[1]。中藥利用該技術可以提高中藥的細胞破壁率，從而提高有效成分的溶出率[2]，提高了藥物的釋放量和釋放速度，有利于藥物的吸收[3]，使得小劑量的超微粉碎破壁中藥即可達到大劑量中藥材的藥效成為可能，極大地節約中藥資源。

黃芪是一味藥用歷史悠久、臨床應用廣泛的傳統補益類中藥，具有免疫調節作用[4-5]。本文建立環磷酰胺小鼠免疫失衡模型，觀察了黃芪超微粉對該模型小鼠免疫功能的影響，并與黃芪飲片進行了比較，為黃芪超微粉的臨床應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 5～6周齡SPF級ICR小鼠60只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號為SCXK(京)2016-0011，所有小鼠飼養SPF屏障環境內，12 h/12 h的光照/黑暗條件，溫度20～26 ℃，自由采食和飲水。

1.1.2 藥材及儀器 黃芪飲片購自北京同仁堂藥店；環磷酰胺購自山西普德藥業股份有限公司；CD3、CD19、CD314抗體購自BD公司；PHA購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；MTT購自Sigma公司；IL-2和INF-γ Elisa試劑盒購自RayBiotech公司。流式細胞儀(貝克曼Cytoflex)，MultiskanGO酶標儀(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及給藥方法 5～6周齡昆明種小鼠60只，隨機分為對照組(Con)、模型組(M)、黃芪飲片組(HQY，10 g/kg)、黃芪超微粉高劑量組(HQFH，10 g/kg)、黃芪微細粉中劑量組(HQFM，2 g/kg)、黃芪微細粉低劑量組(HQFL，0.4 g/kg)，每組10只，雌雄各半。模型組和各藥物組腹腔注射環磷酰胺(80 mg/kg)，連續4天，然后每周強化1次，共強化2次，與末次強化后第1天，取材進行指標檢測。各藥物組從模型制備第1天開始給藥直至取材前一天，對照組和模型組給與相同體積生理鹽水。

1.2.2 胸腺指數和脾指數 稱取小鼠體重、胸腺重量、脾臟重量，計算脾指數。胸腺指數=胸腺重量/體重；脾指數=脾臟重量/體重

1.2.3 脾臟淋巴細胞增殖轉化和細胞因子分泌測定 無菌取出脾臟，置于盛有適量RPMI 1640培養基平皿中磨碎，用無菌培養基洗1次，加入適量紅細胞裂解5 min，無菌培養基洗1次，用70 μm細胞篩濾過得到游離單個脾細胞，臺盼蘭計數活細胞數，調整細胞濃度為2×106個/mL，將細胞懸液分兩孔加入96孔板，每孔200 μL，其中一孔加入5 μL PHA(終濃度1 μg/mL)，另一孔作為對照，置于培養箱中培養3 d，于培養結束前4 h取出，每孔吸出上清100 μL待用，加入10 μL MTT(5 mg/mL)，作用4 h后加入DMSO 150 μL，震蕩混勻，用酶標儀570 nm處測OD值。刺激指數=(加PHA細胞OD值-不加PHA細胞OD值)/不加PHA細胞OD值。脾細胞上清IL-2和INF-γ細胞因子采用ELISA法測定，按照試劑盒說明操作。

1.2.4 外周血和脾臟免疫細胞分群檢測 末次給藥后眼眶取血，提取血漿后，將血細胞加入紅細胞裂解液裂紅，2% FBS-PBS液體洗1次，用2% FBS-PBS液體重懸細胞，取出100 μL到流式管中，加入抗體，混勻避光孵育20 min，加入lysing buffer，混勻避光孵育15 min，300 g離心5 min后，棄上清，再加入2 mL 2% FBS0-PBS液體洗2次，上流式細胞儀檢測。脾臟置入2 mL的2% FBS-PBS培養皿中研磨，200目細胞篩過濾，將血細胞加入紅細胞裂解液裂紅，2% FBS-PBS液體洗1次，300 g 5 min離心后棄上清，與血中免疫細胞處理方式相同。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，采用均值加減標準差表示統計量，計量資料采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪超微粉對小鼠胸腺指數和脾指數的影響

與對照組比較，80 mg/kg環磷酰胺可以使小鼠胸腺指數明顯降低，黃芪飲片以及各黃芪超微粉組可以明顯升高胸腺指數。與對照組比較，80 mg/kg環磷酰胺可以造成小鼠脾臟腫大，脾指數明顯升高，黃芪飲片以及各黃芪超微粉組可以明顯降低脾指數。見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。圖1 黃芪超微粉對小鼠胸腺指數和脾指數的影響

2.2 黃芪超微粉對小鼠脾細胞淋巴細胞增殖轉化和分泌細胞因子能力的影響

與對照組比較，環磷酰胺模型組脾淋巴細胞刺激指數明顯降低；與環磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組以及黃芪超微粉各組的淋巴細胞刺激指數顯著增加。與對照組比較，環磷酰胺模型組脾細胞上清中的IL2和INFγ的含量顯著降低；與環磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組以及黃芪超微粉各組的脾細胞上清中的IL2和INFγ的含量顯著增加。見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。圖2 黃芪超微粉對小鼠脾細胞淋巴細胞刺激指數和脾上清細胞因子的影響

2.3 黃芪超微粉對免疫細胞亞群的影響

2.3.1 黃芪超微粉對外周血免疫細胞亞群的影響 與對照組比較，環磷酰胺組CD3+細胞比例明顯增高，與環磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組，黃芪超微粉中劑量、高劑量組的CD3+細胞比例明顯降低；與對照組比較，環磷酰胺組CD19+、CD314+細胞比例明顯降低，與環磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組，黃芪超微粉低劑量、中劑量、高劑量組的CD19+、CD314+細胞比例明顯升高。見圖3。

2.3.2 黃芪超微粉對脾臟免疫細胞亞群的影響 與對照組比較，環磷酰胺組CD3+細胞比例明顯增高，與環磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組，黃芪超微粉低劑量、中劑量、高劑量組的CD3+細胞比例明顯降低；與對照組比較，環磷酰胺組CD19+細胞比例明顯降低，與環磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組，黃芪超微粉中劑量、高劑量組的CD19+細胞比例明顯升高；與對照組比較，環磷酰胺組CD314+細胞比例明顯降低，與環磷酰胺模型組比較，黃芪飲片組，黃芪超微粉低劑量、中劑量、高劑量組的CD314+細胞比例明顯升高。見圖4。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。圖3 黃芪超微粉對外周血免疫細胞亞群的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。圖4 黃芪超微粉對脾臟免疫細胞亞群的影響

3 討論

傳統中藥飲片細胞破壁率極低(小于3%)，細胞內的中藥有效成分釋放率低，不能充分發揮藥效。超微粉碎技術使中藥細胞壁在粉碎過程中大量被破壞，有效成分不需要通過細胞壁和細胞膜即能釋放出來，提高了藥物的釋放量和釋放速度，極大地提高中藥藥效[6]。本研究通過觀察黃芪超微粉對環磷酰胺致免疫失衡小鼠的免疫功能的影響，為黃芪超微粉的臨床應用提供依據。

胸腺和脾臟分別是機體的中樞和外周免疫器官，前者是免疫細胞發生、分化和成熟的場所，后者是成熟免疫細胞定居的場所，也是免疫細胞在抗原刺激下發生免疫應答的部位[7]。本研究結果顯示，環磷酰胺可以致小鼠胸腺指數降低，脾指數升高，脾細胞刺激指數降低，與相應學者的報道結果基本一致[7-9]。模型組脾指數升高是由于環磷酰胺致小鼠脾臟代償性增大所引起的，原因可能是環磷酰胺抑制骨髓，導致貧血，脾臟代償性造血所致。IL2和INFγ是具有廣泛免疫調節作用的淋巴因子。IL-2主要由T細胞產生，可以激活T細胞，促進T細胞生長，調節CD4+T細胞的分化，調節CD8+T細胞的效應和記憶反應[10]。INF-γ主要由輔助T細胞和NK細胞產生，具有廣泛的免疫調節作用，是可以調節CD4+T細胞和CD8+T細胞極化的細胞因子[11]。CD3、CD19是T細胞、B細胞表面標志物，CD314在NK細胞中表達，激活殺傷細胞的先天免疫反應，導致細胞毒性活動，參與NK細胞介導的骨髓移植排斥反應，可能對NK細胞的分化和存活起調節作用[12]。本研究結果顯示環磷酰胺組小鼠脾細胞上清細胞因子IL2和INFγ含量減少，外周血和脾臟中的CD3+細胞比例明顯升高，CD19+和CD314+細胞比例明顯降低。這些結果提示環磷酰胺可以導致小鼠的細胞免疫、體液免疫以及先天免疫功能失調。

本研究中，黃芪飲片以及黃芪超微粉可以提高環磷酰胺所致胸腺指數降低。程昊[13]、陳潔君等[14]也發現黃芪超微粉和破壁粉可以提高動物的胸腺指數，與我們的研究結果一致。同時本研究發現黃芪飲片以及黃芪超微粉可以逆轉環磷酰胺引起的脾腫大，降低脾指數，增高脾細胞刺激指數和脾細胞上清細胞因子IL2和INFγ含量。黃芪飲片和黃芪超微粉各組可以降低環磷酰胺模型組小鼠外周血和脾臟中的CD3+細胞比例，明顯升高CD19+和CD314+細胞比例，提示黃芪飲片以及各劑量黃芪超微粉能夠有效對抗環磷酰胺所致的免疫失衡。值得注意的是：小劑量黃芪超微粉組即可以達到黃芪飲片的藥效，但是黃芪超微粉高、中、低劑量組差異不顯著，是否與黃芪超微粉的生物利用度有關，尚待進一步研究。