基于王三虎“燥濕相混致癌說”探究半邊蓮治療癌癥的作用及物質(zhì)基礎(chǔ)

王雪梅，吳凡偉，李彥榮

[1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405；2.深圳市寶安中醫(yī)院（集團(tuán)），廣東深圳518100]

半邊蓮為桔梗科植物半邊蓮Lobelia chinensisLour.的干燥全草，具有清熱解毒、利尿消腫之功效，用于癰腫疔瘡、蛇蟲咬傷、臌脹水腫、濕熱黃疽、濕疹濕瘡等癥[1]，臨床常用于支氣管炎、支氣管肺炎、呼吸道感染和嬰兒腹瀉等的治療[2-4]。半邊蓮喜歡潮濕的環(huán)境，分布于我國長江中下游及以南各省區(qū)，別名細(xì)米草、急解索、半邊花、蛇脷草、長蟲草。近年來，有學(xué)者通過各種藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)半邊蓮在抗腫瘤、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞、鎮(zhèn)痛消炎、抑制α-葡萄糖苷酶、抗心肌缺血再灌注等方面具有顯著作用，其應(yīng)用于各種臨床實(shí)踐中取得了良好的治療效果[5]。有研究[6-7]報道，半邊蓮的活性成分具有一定的抗癌作用，如何珊等[8]通過觀察半邊蓮生物堿對U266細(xì)胞的體外增殖及細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)半邊蓮可能通過提高癌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

陜西省名中醫(yī)、廣西省名中醫(yī)王三虎教授認(rèn)為抗癌治療癥狀的消除就是人體的陰陽趨于和諧的表現(xiàn)。王三虎教授認(rèn)為“風(fēng)為百病之長”，腫瘤的形成與六氣息息相關(guān)，尤其是燥、濕，即燥濕相混是貫穿于某些癌癥始終的矛盾[9]，由此提出了“燥濕相混致癌論”，并以此理論指導(dǎo)使用利水藥牽牛子治療盆腔癌、前列腺癌及結(jié)腸癌、直腸癌，均取得良好療效。因此，本研究基于“燥濕相混致癌說”，探討利水消腫中藥半邊蓮治療癌癥的作用。為了進(jìn)一步探究中醫(yī)學(xué)利用半邊蓮抗癌的物質(zhì)基礎(chǔ)并尋找可能的抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性成分，本研究又對半邊蓮干燥全草進(jìn)行了系統(tǒng)化學(xué)成分分離以及活性研究。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥半邊蓮（采于四川省雅安市），由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市寶安中醫(yī)院吳凡偉教授鑒定為桔梗科植物半邊蓮（Lobelia chinensisLour.）全草。

1.2 試劑與儀器反相材料RP-C18（美國Merck公司）；MCI-GEL CHP-20P（三菱化學(xué)公司）；柱層析硅膠、薄層層析硅膠（青島海洋化工廠）；凝膠材料Sephadex LH-20（GE保健生物科學(xué)）；顯色劑（5%硫酸乙醇溶液、5%香草醛濃硫酸溶液）；半制備C18柱（Agilent SB-C18column 250 mm×9.4 mm，5 mm）；有機(jī)溶劑（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）。RPIM-1640（上海立菲生物技術(shù)有限公司）；10%胎牛血清（HyClone）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、順鉑（美國Sigma公司）。全自動旋光儀（Anton-Paar MCP 200）；核磁共振儀（Bruker AV-400-Ⅲ和Bruker AV-500-Ⅲ）；低分辨質(zhì)譜儀（Agilent 1200 series LC-MS/MS system）；高 分 辨 質(zhì) 譜 儀（Shimadzu LCMS-IT-TOF）；酶標(biāo)儀（Thermo）。

1.3 提取與分離將干燥的半邊蓮全草（3 kg）粉碎后，過60目篩，用95%的乙醇（3×60 L）室溫下浸提3次。所得浸提液合并減壓濃縮后得其浸膏，浸膏混懸于1 L水中，再用乙酸乙酯（4×1 L）萃取，濃縮后得到乙酸乙酯部分浸膏（100 g）。乙酸乙酯部分浸膏用石油醚/乙酸乙酯（1∶0，10∶1，3∶1，1∶1，1∶4，0∶1）經(jīng)由硅膠柱梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層板分析后，將表現(xiàn)相近的組分合并，共分離得到4個組分（A~D）。B組分（16 g）用二氯甲烷/甲醇（300∶1~30∶1）經(jīng)由硅膠柱梯度洗脫得到3個部分（B1~B3）。B2部分（2 g）經(jīng)由MCI柱，用甲醇/水（30%~100%）洗脫得到4個部分（B2a~B2d）。B2b部分（800 mg）再經(jīng)過硅膠柱層析得到3個部分（B2b1~B2b3）。其中，B2b2通過高效液相色譜（HPLC）分離得到2個化合物——化合物1（15 mg）、化合物2（10 mg）。B1組分經(jīng)由RP-C18柱（甲醇/水，40%~90%，v/v）得到3個亞組分（B1a1~B1a3）。B1a3部分通過硅膠柱（石油醚/乙酸乙酯，20∶1~1∶1）分離得到化合物6（12 mg）。B1a2部分通過HPLC分離得到化合物3（8.5 mg）。C組分（1.6 g）用二氯甲烷/乙酸乙酯（200∶1~1∶1）經(jīng)硅膠柱梯度洗脫得到3個組分（C1~C3）。C1部分經(jīng)RPC18柱（甲醇/水，50%~100%，v/v）得到4個部分（C1a~C1d）。C1b部分在二氯甲烷/甲醇（1∶1）體系中重結(jié)晶得到化合物4（100 mg），剩余部分經(jīng)硅膠柱（環(huán)己烷/乙酸乙酯，4∶1~1∶1）純化得到化合物5（15 mg）。

1.4 化合物抑制癌細(xì)胞增殖活性的篩選人乳腺癌細(xì)胞MCF-7由中山大學(xué)微生物與生化制藥研究室提供；人胃癌細(xì)胞MGC-803購自美國保藏中心ATCC。以順鉑作為陽性對照，采用MTT法[10-11]對半邊蓮中分離得到的6個化合物，應(yīng)用MCF-7和MGC-803細(xì)胞模型進(jìn)行抗癌活性評價。用RPMI-1640、10%胎牛血清、1%的雙抗所配的培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。96孔板種板前，對細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔2 000~4 000個細(xì)胞，每孔100 μL培養(yǎng)基，孵育1 d后，加藥。其中，空白對照組為培養(yǎng)基，陰性對照組為不加藥處理的細(xì)胞，加順鉑處理作為陽性對照組。48 h后，加入用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制好的5 mg/mL的MTT 20 μL處理4 h，再棄去培養(yǎng)基，每孔加入120 μL DMSO，振蕩10 min，最后用酶標(biāo)儀測定其在492 nm波長處的吸光度（OD）值。根據(jù)OD值計(jì)算出各藥物濃度對細(xì)胞的抑制率，通過GraphPad Prism軟件，采用非線性回歸計(jì)算出各化合物的半數(shù)抑制濃度（IC50）值[12]。

2 結(jié)果

2.1 提取物結(jié)構(gòu)鑒定化合物1為白色固體，C20H22O6，ESI-MS：m/z359[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH7.53（1H，d，J=8.4 Hz），7.21（1H，d，J=7.8 Hz），7.01（1H，d，J=1.8 Hz），6.95（1H，dd，J=7.8，1.8 Hz），6.78（1H，d，J=1.8 Hz），6.69（1H，dd，J=8.4，1.8 Hz），4.11（1H，t，J=8.4 Hz），3.87（1H，t，J=9.0 Hz），3.81（3H，s），3.77（3H，s），3.16（1H，dd，J=13.8，5.4 Hz），3.09（1H，dd，J=13.8，6.6 Hz），2.79（1H，ddd，J=9.0，6.6，5.4 Hz），2.73（1H，dd，J=13.8，5.4 Hz），2.62（1H，m），2.51（1H，dd，J=13.6，9.0 Hz）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC178.9（s，C-9），146.8（s，C-3），146.7（s，C-3’），144.7（s，C-4’），144.5（s，C-4），129.9（s，C-1），129.7（s，C-1’），122.2（d，C-6’），121.5（d，C-6），114.5（d，C-5’），114.2（d，C-5），111.6（d，C-2’），111.1（d，C-2），71.5（t，C-9’），56.0（q，OCH3），55.9（q，OCH3），46.7（d，C-8），41.1（d，C-8’），38.5（t，C-7’），34.7（t，C-7）。與文獻(xiàn)研究[13]報道的Matairesinol一致，故結(jié)構(gòu)鑒定為Matairesinol。見圖1。

圖1 化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of compound 1

化合物2為白色固體，C21H26O6，ESI-MS：m/z375[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH6.79（1H，d，J=8.5 Hz，H-5），6.77（1H，d，J=8.5 Hz，H-5’），6.59（1H，dd，J=8.0，1.9 Hz，H-6），6.54（1H，dd，J=8.0，1.9 Hz，H-6’），6.50（1H，d，J=1.9 Hz，H-2），6.42（1H，d，J=1.9 Hz，H-2’），4.72（1H，d，J=1.5 Hz，H-9），4.02（1H，dd，J=8.6，7.1 Hz，H-9’a），3.80（3H，s，OMe），3.79（3H，s，OMe），3.65（1H，t，J=8.1 Hz，H-9’b），3.31（3H，s，H-9OMe），2.69（1H，dd，J=13.8，7.4 Hz，H-7a），2.54（2H，d，J=7.3 Hz），2.39（1H，dd，J=13.8，7.4 Hz，H-7’a），2.14（2H，m，H-8），2.14（2H，m）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC146.6（s，C-4’），146.5（s，C-4），144.1（s，C-3），143.9（s，C-3’），132.6（s，C-1’），131.7（s，C-1），121.7（d，C-6），121.3（d，C-6’），114.2（d，C-2’），114.1（d，C-5），111.2（d，C-2），111.1（d，C-5’），110.2（d，C-9），72.3（t，C-9’），55.8（q，OMe），54.9（q，C-9OMe），52.5（d，C-8’），45.9（d，C-8），39.4（t，C-7’），38.9（t，C-7）。與文獻(xiàn)研究[14]報道的（8S，9S，8’S）-4，4’-Dihydroxy-3，3’，9-trimetoxy-9，9’-epoxylignan一致，故結(jié)構(gòu)鑒定為（8S，9S，8’S）-4，4’-Dihydroxy-3，3’，9-trimetoxy-9，9’-epoxylignan。見圖2。

圖2 化合物2的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 2 Chemical structure of compound 2

化合物3為白色固體粉末，C30H50O，ESI-MS：m/z427[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH4.68（2H，s，H-30），3.13（1H，dd，J=5.3，11.5 Hz，H-3），2.56（1H，m，H-21），1.85（1H，m，H-7a），1.73（1H，m，H-20a），1.65（3H，s，H-29），1.60（1H，m，H-2a），1.50（4H，m，H-2b，16a，19a，20b），1.42（1H，m，H-6a），1.36（2H，m，H-11a，16b），1.30（5H，m，H-1，12，17），1.24（2H，m，H-5，13），1.21（2H，m，H-15），1.20（5H，m，H-6b，7b，26），0.92（2H，m，H-11b，19b），0.88（3H，s，H-23），0.79（3H，s，H-25），0.77（3H，s，H-27），0.68（3H，s，H-28），0.60（3H，s，H-24）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC33.3（t，C-1），29.3（t，C-2），79.4（d，C-3），39.3（s，C-4），48.1（d，C-5），19.2（t，C-6），35.0（t，C-7），43.2（s，C-8），46.1（d，C-9），37.1（s，C-10），22.6（t，C-11），24.5（t，C-12），49.9（d，C-13），41.8（s，C-14），33.8（t，C-15），21.6（t，C-16），55.3（d，C-17），45.0（s，C-18），41.9（t，C-19），27.5（t，C-20），46.6（d，C-21），148.9（s，C-22），29.2（q，C-23），16.1（q，C-24），22.8（q，C-25），22.8（q，C-26），17.3（q，C-27），16.3（q，C-28），25.2（q，C-29），110.2（t，C-30）。以上波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)研究[15]報道的3β-hydroxyhop-22（29）-ene基本一致，故鑒定化合物3為3β-hydroxyhop-22（29）-ene。見圖3。

圖3 化合物3的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 3 Chemical structure of compound 3

化合物4為黃色粉末，C16H12O5，ESI-MS：m/z285[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH12.29（1H，s，OH-1），12.19（1H，s，OH-11），7.61（1H，s，H-4），7.35（1H，d，J=2.5 Hz，H-8），7.06（1H，s，H-2），6.67（1H，d，J=2.5 Hz，H-10），3.92（3H，s，CH3O-9），2.43（3H，s，H-15）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC162.7（s，C-1），124.7（d，C-2），148.7（s，C-3），121.5（d，C-4），135.5（s，C-5），182.3（s，C-6），133.4（s，C-7），108.5（d，C-8），166.8（s，C-9），107.0（d，C-10），165.4（s，C-11），110.5（s，C-12），191.0（s，C-13），113.9（s，C-14），22.4（q，C-15），56.3（q，CH3O-9）。與文獻(xiàn)研究[16]報道的化合物parietin一致，故結(jié)構(gòu)鑒定為parietin。見圖4。

圖4 化合物4的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 4 Chemical structure of compound 4

化合物5為黃色粉末，C15H10O4，ESI-MS：m/z255[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH 12.09（1H，s，OH-1），11.98（1H，s，OH-11），7.80（1H，dd，J=8.3，1.1 Hz，H-8），7.65（1H，br d，J=8.3 Hz，H-9），7.63（1H，br s，H-4），7.27（1H，d，J=8.3，1.1 Hz，H-10），7.06（1H，s，H-2），2.44（3H，s，H-15）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC162.9（s，C-1），124.8（d，C-2），149.6（s，C-3），121.6（d，C-4），133.9（s，C-5），182.2（s，C-6），133.5（s，C-7），120.2（d，C-8），137.2（d，C-9），124.6（d，C-10），162.6（s，C-11），114.0（s，C-12），192.08（s，C-13），116.1（s，C-14），22.5（q，C-15）。與文獻(xiàn)研究[17]報道的化合物chrysophanol一致，故結(jié)構(gòu)鑒定為chrysophanol。見圖5。

圖5 化合物5的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 5 Chemical structure of compound 5

化合物6白色固體，C16H18O4，ESI-MS：m/z275[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH5.01（1H，d，J=17.5 Hz），4.85（1H，d，J=17.5 Hz），3.85（1H，d，J=11.5 Hz），3.47（1H，d，J=11.5 Hz），2.73（1H，m），2.47（1H，m），2.28（1H，m），1.90（1H，m），1.84（1H，m），1.70（1H，m），1.38（1H，m），1.30（1H，m），1.22（3H，s），0.82（3H，s）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC181.0（s，C-14），163.8（s，C-12），158.9（s，C-8），132.4（s，C-7），121.9（d，C-11），111.9（d，C-9），71.4（d，C-6），69.7（t，C-13），47.9（d，C-5），42.9（s，C-4），35.2（s，C-10），29.7（t，C-1），27.8（t，C-3），24.9（q，C-16），24.2（q，C-15），17.5（t，C-2）。與文獻(xiàn)研究[18]報道的gaultheriadiolide一致，故結(jié)構(gòu)鑒定為gaultheriadiolide。見圖6。

圖6 化合物6的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 6 Chemical structure of compound 6

2.2 化合物抑制癌細(xì)胞增殖活性篩選結(jié)果結(jié)果如圖7所示，在20 μmol/L濃度下，化合物1和2抑制MCF-7和MGC-803細(xì)胞增殖率大于50%。因此，繼續(xù)對這2個化合物抑制細(xì)胞增殖的IC50進(jìn)行測試。

圖7 半邊蓮中分離化合物（1~6）對MCF-7（A）和MGC-803（B）細(xì)胞的抑制活性Figure 7 The inhibitory activity of compounds（1-6）isolated from Lobelia on MCF-7 and MGC-803 cells

活性測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物1、2具有顯著的抑制乳腺癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞增殖活性，其IC50值如表1所示。

表1 半邊蓮中分離化合物1和化合物2對MCF-7和MGC-803細(xì)胞增殖活性的IC50值Table 1 The IC50 value of compound 1 and compound 2 isolated from Lobelia chinensis Lour.on the viability of MCF-7 and MGC-803 cells （±s）

表1 半邊蓮中分離化合物1和化合物2對MCF-7和MGC-803細(xì)胞增殖活性的IC50值Table 1 The IC50 value of compound 1 and compound 2 isolated from Lobelia chinensis Lour.on the viability of MCF-7 and MGC-803 cells （±s）

化合物順鉑化合物1化合物2 IC50/（μmol·L-1）MCF-7 8.6±0.4 15.1±0.9 18.7±0.6 MGC-803 6.4±0.2 13.4±1.4 9.2±0.8

3 討論

癌病是多種惡性腫瘤的總稱，以臟腑組織發(fā)生異常增生為特征。中醫(yī)學(xué)上稱癌癥為“癥瘕”“積聚”等，如《諸病源候論·卷之十九》曰：“積聚者，乃由陰陽不和，臟腑虛弱，受于風(fēng)邪，搏于臟腑之氣所為也。”腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疑難疾病之一，根據(jù)最新的全球腫瘤數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球新增腫瘤病例1 810萬，970萬腫瘤患者死亡，2020年腫瘤成為人類健康的“頭號殺手”[19]。中醫(yī)藥治療腫瘤的歷史悠久，據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，服用中藥治療惡性腫瘤的患者有三分之二以上[20]，因此，對抗腫瘤中藥的再研究與開發(fā)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

本研究結(jié)果顯示，從中藥半邊蓮的乙醇提取物中分離鑒定了6個化合物，其中化合物1、2、6為木脂素類，化合物3為三萜類，化合物4、5為黃酮類。對分離得到的所有化合物進(jìn)行癌細(xì)胞毒活性測試以評價其抗癌活性，發(fā)現(xiàn)化合物1、2具有潛在的抗胃癌和乳腺癌活性（濃度為20 μmol/L時，其抑制率大于50%），其中化合物2對MGC-803細(xì)胞增殖活性的IC50為9.2 μmol/L。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，中藥半邊蓮發(fā)揮抗癌活性作用的可能為木脂素類化合物，初步闡明了半邊蓮抗癌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，為基于“燥濕相混致癌說”探究中藥半邊蓮在治療癌癥的作用及物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。

綜上所述，通過對半邊蓮抗癌活性成分的深入研究，可以為低毒高效的抗癌新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。有關(guān)半邊蓮抗癌作用物質(zhì)基礎(chǔ)的研究仍有待進(jìn)一步深入開展。