基于內(nèi)膜-肌層交界區(qū)細(xì)胞探討少腹逐瘀湯對(duì)子宮腺肌病的鎮(zhèn)痛作用

吳思寧，譚雅文，葉潤英

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東廣州510120）

子宮腺肌病（adenomyosis）是一種良性子宮疾病，病理表現(xiàn)為在距離子宮內(nèi)膜和肌層之間的交界區(qū)2 mm以上的肌層內(nèi)出現(xiàn)子宮內(nèi)膜腺體[1]，臨床癥狀主要表現(xiàn)為子宮增大、痛經(jīng)、異常子宮出血以及不孕不育。近年來，該病的發(fā)病率不斷上升，且有年輕化的趨勢(shì)，已逐漸成為婦科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本課題組前期大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥治療在改善子宮腺肌病臨床癥狀、調(diào)經(jīng)助孕、控制病灶發(fā)展及降低復(fù)發(fā)率等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，通過不斷總結(jié)前輩經(jīng)驗(yàn)[2-3]，采用少腹逐瘀湯治療子宮腺肌病引起的女性下腹痛獲得了較好的臨床療效。本研究采用體外分離培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜-肌層交界區(qū)（EMI）平滑肌細(xì)胞，應(yīng)用少腹逐瘀湯水提液進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步探討少腹逐瘀湯治療子宮腺肌病的作用機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用治療子宮腺肌病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本選取收集2019年至2021年在廣東省中醫(yī)院婦科住院且擬行全宮切除的30~50歲非絕經(jīng)期子宮腺肌病疼痛患者3例，疼痛視覺模擬量表（VAS）評(píng)分均大于7分，近半年未行激素類藥物治療。手術(shù)室無菌操作獲取標(biāo)本，切開子宮并刮除宮內(nèi)膜，取內(nèi)膜下厚約0.5 cm平滑肌層組織1塊，約2 cm×2 cm，置于磷酸鹽緩沖液（PBS）冰浴，0.5 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)。

1.2 藥物及制備少腹逐瘀湯組成配比為當(dāng)歸∶川芎∶赤芍∶肉桂∶小茴香∶五靈脂∶沒藥∶蒲黃∶延胡索∶干姜=3∶1∶2∶1∶0.5∶2∶1∶3∶1∶1。以上中藥材均購自康美藥業(yè)。取同一批次藥材并精準(zhǔn)稱量，煎煮2次：第1次加10倍量去離子水煎藥2 h，第2次再加入8倍量去離子水煎藥2 h。混合2次水提液，配制成100 mg/mL的母液，用0.22 μm濾過器過濾2次，分裝成3 mL小樣，-20℃保存。

1.3 主要試劑與儀器高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購自美國Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Sigma公司）；細(xì)胞鑒定試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，其中包括細(xì)胞角蛋白（CK）抗體和波形蛋白（Vimentin）抗體；人平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體購自美國Abcam公司；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）兔抗、白細(xì)胞介素6（IL-6）兔抗、神經(jīng)生長因子（NGF）兔抗（北京Bioss公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）小鼠單抗（上海康成公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠免疫球蛋白（IgG）抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德公司）；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d UTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法試劑盒（瑞士Roche公司）；雌二醇（E2）、前列腺素E2（PG-E2）、雌激素受體（ER）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢華美公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析試劑盒（上海博彩公司）；Marker（美國Thermo Scientific Pierce公司）。DV300-1型顯微鏡、TS2光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；170-200P CO2培養(yǎng)箱（英國RS Biotech公司）；JSY-SC-021H全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器（深圳博大博聚公司）；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾公司）。

1.4 EMI細(xì)胞原代培養(yǎng)、鑒定以及生長曲線繪制無菌操作下將獲取的標(biāo)本剪碎，消化、終止反應(yīng)后離心取沉淀細(xì)胞，用含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分裝于T-25培養(yǎng)瓶中。置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，換液，再次置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，2~3 d換液1次。待細(xì)胞融合率達(dá)到80%~90%，吸出培養(yǎng)液并用PBS洗凈，用2.5 g/L胰蛋白酶消化、離心、取細(xì)胞沉淀。細(xì)胞沉淀分2批：一批凍存留種；另一批重新用T-25瓶培養(yǎng)，2~3 d換液1次，按照1∶3~1∶4比例傳代。培養(yǎng)至達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，即可進(jìn)行鋪板和加藥操作。其中，第1代細(xì)胞行細(xì)胞鑒定和生長曲線觀察，第2~5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)操作。

取第1代細(xì)胞于24孔板爬片。細(xì)胞成功爬片后，PBS漂洗，用95%乙醇固定；PBS漂洗，0.5%TritonX-100室溫處理；PBS漂洗，滴加一抗α-平滑肌蛋白（α-SMA）、CK（均稀釋100倍），波形蛋白Vimentin（稀釋200倍），空白對(duì)照組加PBS，4℃孵育過夜；PBS漂洗后再用3% H2O2室溫封閉；PBS漂洗，滴加DAKO REALTMEnVisionTM/HRP（兔/小鼠）抗體，室溫（25~27℃）孵育30 min；PBS洗3次，DAB底物工作液顯色，鏡下掌握顯色程度；蒸餾水洗，蘇木素輕度復(fù)染、飽和磷酸氫二鈉分化；脫水、透明、封片、鏡檢，進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

取第1代和第3代細(xì)胞，用24孔板進(jìn)行細(xì)胞鋪板，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 d換液1次。每天分別從第1代和第3代細(xì)胞鋪板中分別抽取3個(gè)孔，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，共10 d。繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 MTT法測定少腹逐瘀湯對(duì)EMI細(xì)胞的增殖抑制率待細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求制備成懸液，以7 000個(gè)/孔、100 μL/孔的密度接種于96孔板，分4組（對(duì)照組，中藥低、中、高濃度組），培養(yǎng)24 h后加入不含血清的高糖DMEM（基礎(chǔ)培養(yǎng)液），置于培養(yǎng)箱中饑餓處理24 h；中藥低、中、高濃度組分別加入10、20、40 g/L少腹逐瘀湯水提液（母液用無血清的DMEM配制），對(duì)照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；輕緩吸走培養(yǎng)液，加入100 μL的MTT培養(yǎng)液（90 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10 μL MTT母液5 mg/mL），放入培養(yǎng)箱中孵育4 h；再吸去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，震蕩10 min至結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測量各孔570 nm波長處吸光度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（%）。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。確定少腹逐瘀湯抑制EMI細(xì)胞增殖的最佳濃度，作為實(shí)驗(yàn)組，用于后續(xù)研究。

1.5.2 TUNEL法測定EMI細(xì)胞凋亡率取6孔板細(xì)胞爬片達(dá)70%~80%時(shí)，進(jìn)行干預(yù)誘導(dǎo)（實(shí)驗(yàn)組加入含20 g/L濃度少腹逐瘀湯中藥的基礎(chǔ)培養(yǎng)液；對(duì)照組僅加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液）24 h后，用40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，PBS漂洗3次，制作細(xì)胞樣本。用3%H2O2-甲醇溶液室溫封閉，蒸餾水洗3次；滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫靜置20 min；用含0.1%TritonX-100的檸檬酸鈉溶液冰上孵育爬片2 min；加TUNEL反應(yīng)混合液（每45 μL標(biāo)志液，加5 μL酶液）37℃染色1 h，PBS室溫浸洗3次；加Converter-POD反應(yīng)液室溫孵育30 min后充分浸洗；鏡下控制DAB顯色程度；用去離子水沖洗終止反應(yīng)，復(fù)染，脫水，封片，光學(xué)顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)。

1.5.3 ELISA法檢測E2、PG-E2和ER水平藥物處理細(xì)胞24 h后，按照上述指標(biāo)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別測定OD值。其中，E2指標(biāo)采用細(xì)胞上清液，PG-E2和ER指標(biāo)采用細(xì)胞沉淀進(jìn)行檢測。

1.5.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測EMI細(xì)胞VEGF、IL-6、NGF蛋白表達(dá)各組細(xì)胞處理后，棄培養(yǎng)液，用冷PBS清洗3遍后，采用放射免疫沉淀分析（RIPA）冰上裂解30 min，4℃離心收集上清液，BCA法測定蛋白濃度；在配膠、灌膠后，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，用TBST液洗膜2次，5%BSA封閉，搖床震動(dòng)，4℃過夜；封閉后加入一抗（兔單克隆抗IL-6抗體以1∶1 000稀釋，兔單克隆抗VEGF抗體以1∶1 000稀釋，兔單克隆抗NGF抗體以1∶800稀釋，小鼠單克隆抗GAPDH抗體以1∶1 000稀釋），4℃靜置過夜；洗滌后加入二抗（HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗小鼠IgG，1∶10 000稀釋）孵育1 h；洗膜，加入電化學(xué)發(fā)光（ECL）液顯色、曝光、定影、拍照。采用SensiAnsys軟件進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析，測定目的條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。檢驗(yàn)正態(tài)性及組間方差齊性：若滿足正態(tài)性與方差齊性，比較同一樣本多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，比較2組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)；若不滿足，則采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人EMI病灶原代細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定收集并成功培育人EMI病灶原代細(xì)胞，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定，結(jié)果見圖1，可見CK、β-SMA、Vimentin蛋白呈陽性表達(dá)（示棕褐色染色）。肌成纖維細(xì)胞在子宮腺肌病的發(fā)展中起重要作用，主要表達(dá)CK和α-SMA；Vimentin蛋白主要存在于中胚層起源的細(xì)胞中，是間質(zhì)細(xì)胞中重要的中間纖維。因此，圖1中3種蛋白的陽性表達(dá)可證實(shí)體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞為子宮腺肌病細(xì)胞。

圖1 體外人內(nèi)膜-肌層交界區(qū)（EMI）病灶原代細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定結(jié)果Figure 1 Culture and identification results of primary cells in human EMI lesions in vitro

2.2 EMI細(xì)胞的生長曲線圖2結(jié)果表明，第1代和第3代的細(xì)胞生長曲線基本相同，且第3代子EMI細(xì)胞的倍增速度比第1代快。兩者經(jīng)過1 d滯留期后開始繁殖，第2~7天均為生長期，其中第5~7天呈對(duì)數(shù)生長，第8天開始進(jìn)入平臺(tái)期，第9天達(dá)至相同細(xì)胞數(shù)。根據(jù)既往文獻(xiàn)研究[4]及本研究實(shí)驗(yàn)觀察，EMI細(xì)胞可原代培養(yǎng)并傳代，10代內(nèi)活力穩(wěn)定，選擇3~6代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥罴选＜?xì)胞接種后4 h開始貼壁，培養(yǎng)24 h后可完全貼壁。

圖2 體外人內(nèi)膜-肌層交界區(qū)（EMI）細(xì)胞的生長曲線Figure 2 Growth curve of EMI cells

2.3 不同濃度少腹逐瘀湯對(duì)EMI細(xì)胞增殖的抑制情況與對(duì)照組比較，中藥高、中、低濃度組EMI細(xì)胞增殖抑制率降低（P＜0.05），其中，高、中濃度組效果更顯著（P＜0.05）；中濃度組與高濃度組的抑制作用比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具體結(jié)果見表1。

表1 各組體外人內(nèi)膜-肌層交界區(qū)（EMI）細(xì)胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of the inhibition rate in human EMI cell proliferation in vitro among various groups（±s）

表1 各組體外人內(nèi)膜-肌層交界區(qū)（EMI）細(xì)胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of the inhibition rate in human EMI cell proliferation in vitro among various groups（±s）

秩和檢驗(yàn)：①P＜0.05，與對(duì)照組比較；單因素檢驗(yàn)：②P＜0.05，與中藥低濃度組比較

組別中藥低濃度組中藥中濃度組中藥高濃度組對(duì)照組吸光度（OD）值0.247 5±0.056 7①0.217 8±0.044 8①0.220 2±0.052 5①0.771 2±0.048 6細(xì)胞抑制率/%66.78±1.40 72.11±2.15②71.79±2.51②-

2.4 少腹逐瘀湯對(duì)EMI細(xì)胞凋亡的影響對(duì)照組的EMI細(xì)胞核完整，細(xì)胞核未被明顯褐染；少腹逐瘀湯中藥干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組EMI出現(xiàn)較多棕黃色染色的凋亡細(xì)胞，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）。具體結(jié)果見表2、圖3。

表2 2組體外人內(nèi)膜-肌層交界區(qū)（EMI）細(xì)胞凋亡率比較Table 2 Comparison of the apoptosis rate of human EMI cells in vitro between the two groups（±s，n=3）

表2 2組體外人內(nèi)膜-肌層交界區(qū)（EMI）細(xì)胞凋亡率比較Table 2 Comparison of the apoptosis rate of human EMI cells in vitro between the two groups（±s，n=3）

單樣本t檢驗(yàn)：①P＜0.01，與對(duì)照組比較

組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組細(xì)胞凋亡率/%13.58±0.91①5.13±0.58

圖3 2組體外人凋亡內(nèi)膜-肌層交界區(qū)（EMI）細(xì)胞分布比較（TUNEL染色，×200）Figure 3 Comparison of the distribution of apoptotic humar EMI cells in vitro between the two groups（by TUNEL staining，×200）

2.5少腹逐瘀湯對(duì)EMI細(xì)胞中E2、PG-E2和ER表達(dá)的影響少腹逐瘀湯實(shí)驗(yàn)組的E2、PG-E2、ER含量均低于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 2組體外人內(nèi)膜-肌層交界區(qū)（EMI）細(xì)胞中E2、PG-E2、ER含量比較Table 3 Comparison of contents of E2，PG-E2 and ER in human EMI cells in vitro of the two groups（±s，pg·mL-1；n=3）

表3 2組體外人內(nèi)膜-肌層交界區(qū)（EMI）細(xì)胞中E2、PG-E2、ER含量比較Table 3 Comparison of contents of E2，PG-E2 and ER in human EMI cells in vitro of the two groups（±s，pg·mL-1；n=3）

單因素檢驗(yàn)：①P＜0.05，②P＜0.01，與對(duì)照組比較

組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組E2 73.59±1.22②249.38±58.63 PG-E2 2.40±1.09②16.04±3.39 ER 6.29±2.06①11.01±1.39

2.6 少腹逐瘀湯對(duì)EMI細(xì)胞中IL-6、VEGF、NGF蛋白表達(dá)的影響圖4結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組中少腹逐瘀湯處理后的EMI細(xì)胞中IL-6、VEGF蛋白表達(dá)均下降（P＜0.01），而神經(jīng)生長因子NGF雖亦表達(dá)減弱，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 2組體外人內(nèi)膜-肌層交界區(qū)（EMI）細(xì)胞IL-6、VEGF、NGF蛋白表達(dá)比較Figure 4 Comparison of protein expression of IL-6，VEGF and NGF in human EMI cells in vitro between the two groups

3 討論

子宮腺肌病根據(jù)其臨床癥狀可歸屬于中醫(yī)學(xué)“痛經(jīng)”“癥瘕”等范疇，多是由于瘀血蓄積于胞宮、阻滯氣血沖任所致。臨床上，少腹逐瘀湯治療子宮腺肌病引起的女性下腹痛療效較佳[2-3]，其在對(duì)癥止痛之余還能從根本上弱化腺肌病，改善月經(jīng)和生育。少腹逐瘀湯出自清代《醫(yī)林改錯(cuò)》，由10味中藥組成，方中當(dāng)歸、赤芍、川芎為君藥，具有行氣活血、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之功效；五靈脂、蒲黃、延胡索、沒藥為臣藥，具通利血脈、祛瘀止痛之功；小茴香、干姜、肉桂為佐藥，溫經(jīng)散寒病引諸藥直達(dá)少腹。全方共奏活血化瘀、溫里散寒、散結(jié)止痛之效。現(xiàn)代研究也表明其有改善血液黏度、鎮(zhèn)痛、消炎等作用[5-6]。本研究通過觀察少腹逐瘀湯干預(yù)后EMI細(xì)胞的E2、PG-E2、ER、IL-6、VEGF、NGF水平的變化以及凋亡程度，初步探討該藥治療子宮腺肌病的作用機(jī)制。

本研究采用體外原代培養(yǎng)人子宮腺肌病EMI平滑肌細(xì)胞，成功率為100%，為進(jìn)一步開展分子學(xué)機(jī)制研究提供了重要基礎(chǔ)。總結(jié)EMI細(xì)胞的培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)如下：培養(yǎng)基2~3 d換1次液；細(xì)胞按1∶3~1∶4比例傳代；10代內(nèi)生存活力穩(wěn)定，3~6代細(xì)胞活力最佳。

本研究結(jié)果顯示，少腹逐瘀湯能夠抑制EMI細(xì)胞的增殖，最佳作用濃度為20 g/L，少腹逐瘀湯干預(yù)后的EMI細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）。子宮腺肌病的異位內(nèi)膜侵襲黏附能力強(qiáng)，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜與子宮肌層結(jié)合帶異常，被認(rèn)為是一種增殖性疾病，具備類腫瘤的生物特性。子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展，與細(xì)胞凋亡和增殖失衡有關(guān)[7]。本研究結(jié)果表明，少腹逐瘀湯可促進(jìn)EMI細(xì)胞凋亡，同時(shí)促進(jìn)EMI細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果還顯示，少腹逐瘀湯能明顯降低EMI細(xì)胞上清E2，EMI細(xì)胞PG-E2、ER的水平。子宮腺肌病是一種雌激素依賴性疾病，異位病灶上皮細(xì)胞內(nèi)ER過表達(dá)促使異位組織在肌層內(nèi)種植、生長、發(fā)展。基于正反饋機(jī)制，E2、PG-E2持續(xù)存在于病灶并不斷增加，子宮合成前列腺素（PG）增加，是痛經(jīng)的重要原因，且痛經(jīng)的程度與EMI細(xì)胞的侵襲深度、血管增生有關(guān)[8]。說明子宮腺肌病通過E2與其受體結(jié)合激活基因效應(yīng)及相關(guān)通路，同時(shí)在血管、炎癥、神經(jīng)等不同層面產(chǎn)生相應(yīng)的生物效應(yīng)，誘導(dǎo)疼痛發(fā)生。因此，推斷少腹逐瘀湯通過抑制ER受體表達(dá)，同時(shí)下調(diào)E2、PG-E2水平，進(jìn)而弱化子宮腺肌病并有效改善痛經(jīng)。

為了進(jìn)一步探討少腹逐瘀湯鎮(zhèn)痛的分子機(jī)制，本研究檢測了EMI細(xì)胞相關(guān)致痛因子、炎癥因子、血管生成因子的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，少腹逐瘀湯干預(yù)的EMI細(xì)胞IL-6、VEGF、NGF蛋白表達(dá)均顯著下降，但NGF指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。子宮腺肌病是一種慢性免疫炎性疾病，IL-6是子宮腺肌病炎癥病理狀態(tài)的主要細(xì)胞因子[9]，子宮腺肌病疼痛程度與IL-6有關(guān)[10]。VEGF在子宮腺肌病異位、在位內(nèi)膜中的高表達(dá)，提示局部血供豐富和新生血管形成與子宮腺肌病的發(fā)病及月經(jīng)過多有關(guān)[11]。另外，有研究表明，子宮腺肌病在位內(nèi)膜功能層和病灶中NGF的高表達(dá)與其痛經(jīng)程度呈正相關(guān)[12]。還有臨床研究表明，子宮腺肌病患者血清NGF水平明顯升高，與痛經(jīng)強(qiáng)度密切相關(guān)[13]。考慮本研究NGF的檢測結(jié)果可能與樣本量少、由于經(jīng)費(fèi)受限致購買的抗體不穩(wěn)定等因素有關(guān)；也表明少腹逐瘀湯可以下調(diào)EMI細(xì)胞的NGF蛋白表達(dá)，但并不是其作用的關(guān)鍵途徑之一。由于子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展與E2、ER、PG-E2及IL-6、VEGF關(guān)系密切，加之VEGF和PG-E2均有促血管生成，IL-6有促炎反應(yīng)作用，故推斷少腹逐瘀湯抑制子宮腺肌病EMI細(xì)胞主要與抑制雌激素分泌、血管生成、減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)。

綜上所述，少腹逐瘀湯可有效促進(jìn)人EMI細(xì)胞凋亡，抑制EMI細(xì)胞的增殖，其可能是通過減少雌激素、血管生成因子、炎癥因子的表達(dá)，最終改善子宮腺肌病的痛經(jīng)程度，體現(xiàn)了其中醫(yī)“活血化瘀止痛”功效的特點(diǎn)。