降脂活性小球藻多肽的研究

◎ 楊燕紅，賓雁林，趙大洲，丘鷹昆

（1.沈陽藥科大學 中藥學院，遼寧 本溪 117000；2.廈門大學 藥學院，福建 廈門 361105；3.一陽生生物科技有限公司，福建 廈門 361118）

小球藻（Chlorella cvulgaris）為綠藻門小球藻屬普生性單細胞綠藻，含有豐富的蛋白質、多糖、脂類等。目前研究發現，小球藻的蛋白具有抗氧化[1-2]、抗腫瘤[3-5]、降脂[6]等作用。有文獻報道，小球藻蛋白粗提液對胰脂肪酶（Pancrelipase，PL）活性有抑制作用[6]，而胰脂肪酶[7]是脂肪消化吸收的關鍵酶，抑制其活性可以有效地降低人體對脂肪的消化吸收。目前臨床上普遍使用的胰脂酶抑制劑[7]藥物是奧利司他，但該成分存在一些不良反應，如肝損傷、營養不良、脂肪性大便等胃腸道反應。因此，尋找天然產物中胰脂肪酶抑制劑并完善其制備方法十分重要。小球藻具有抑制胰脂肪酶活性的作用。為此，本文通過多種蛋白酶水解法獲得具有較高抑制胰脂肪酶活性的小球藻多肽。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

小球藻干粉（上海光語生物科技有限公司）；奧利司他（浙江海正藥業）；風味蛋白酶、2709堿性蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶（國藥集團化學試劑有限公司）；537酸性蛋白酶、氨基肽酶（滄州夏盛生物技術有限公司）；復合蛋白、1398中性蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司）；超純水（廈門大學藥學院提供）；乙醇（色譜 純，Fairfleld，CT）；Tris（Sigma公 司）；pNPB（Sigma公司）；DMSO（西隴科學股份有限公司）；Toyopearl尺寸排阻填料HW-40F（北京英萊克科技發展有限公司）；硅藻土（石家莊天旭環?？萍加邢薰荆?/p>

1.2 儀器

球磨機（上海英用機械有限公司）；離心機（德國進口）；酶標儀（IMARK，美國伯樂進口）；水浴鍋（常州國華電器有限公司）；電子天平（CP114METTLER TOLEDO，奧豪斯儀器有限公司）；數控超聲波清洗器（KQ-5200V，昆山市超聲儀器有效公司）。

1.3 小球藻多肽制備方法

1.3.1 破壁提取

準確稱取小球藻粉500 g；超純水5 L，常溫下攪拌均勻后送入球磨機均質30 min，然后將小球藻粉懸濁液置于帶冷卻功能的超聲波提取器中，溫度設置為2～6 ℃，在580 W的超聲功率下超聲20 min，得到粗提液。

1.3.2 離心除雜

將粗提液于4 ℃，轉速為8 000 r·min-1條件下離心30 min，并過濾，之后取上清液檢測其蛋白質濃度，后濃縮至蛋白質含量為2%，得到小球藻水提物。

1.3.3 酶解

將上述所得的小球藻水提物按照表1各酶的水解條件進行酶解處理，經過85 ℃水浴15 min滅酶操作以終止水解反應，室溫冷卻后將水解液經硅藻土過濾，取過濾液經減壓濃縮得到酶解產物，減壓濃縮的參數為真空度0.08～0.10 MPa，濃縮溫度40～60 ℃，濃縮時間2 h[6,8-10]。

表1 不同酶的水解條件表

1.3.4 脂肪酶抑制劑活性評價方法

采用對硝基苯酚法[11-12]測定各組分脂肪酶活抑制率。①PL工作液：準確稱取25 mg PL加5 mL Tris緩沖液，振搖15 min后在18 ℃下離心10 min。②配制底物4-硝基苯丁酸酯（4-nitrophenyl butyrate，pNPB）溶液：量取17.5 μL pNPB，用乙腈定容至10 mL。③稱 取7.57 g Tris，3.65 g NaCl和19.4 mg CaCl2加適量水溶解，用鹽酸調pH至7.4，室溫冷卻，轉移至250 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，4 ℃保存。然后在96孔板中加入175 μL Tris緩沖液（0.25 mol·L-1Tris緩 沖 液，含0.25 mol·L-1NaCl和0.7 mmol·L-1CaCl2，pH=7.4）、20 μL PL工作液、4 μL樣品后，37 ℃中孵育5 min，然后加入1 μL pNPB溶液，2.5 min后使用酶標儀測定405 nm處的OD值，平行3次；奧利司他（Orlistat）代替樣品作為陽性對照，DMSO代替樣品作為不加抑制劑組；抑制率=（AE-AT）/AE×100%，其中，AT為加抑制劑組的OD值，AE為不加抑制劑組的OD值。

1.3.5 活性多肽純化

將1398中性蛋白酶酶解產物用Toyopearl HW-40F進行尺寸排阻色譜分離純化，按出峰情況收集各分離組分，上樣量為500 mg。色譜條件為超純水（A）-乙醇（B）先等度洗脫，0～2 h，100%A；然后梯度洗脫，2～3 h，0～100%B；再等度洗脫，3～4 h 100%B；流速1 mL·min-1，每6 min收集一管，檢測波長280 nm。收集并合并相同色譜峰，得到11個餾分，分別命名為A1～A11，并進行下一步活性篩選。

2 結果與分析

2.1 不同酶水解產物脂肪酶抑制率比較

將按照1.3.3酶解條件得到的酶解產物配制成4 mg·mL-1，并分別進行脂肪酶抑制活性篩選，且與陽性藥奧利司他（Orlistat）進行對比，各酶解產物對脂肪酶活性的抑制率如表2所示。由表2可知，1398中性蛋白酶的酶解產物具有較好的脂肪酶抑制活性，其余酶解產物則對脂肪酶活性無抑制作用或抑制程度較低。

2.2 中性蛋白酶解產物活性部位確定

A1～A11各組分色譜圖如圖1所示。該部分經減壓濃縮后，通過MALDI-TOF MS測定各組分多肽分子量[13]，并鑒定各組分對脂肪酶的抑制活性，其中脂肪酶活抑制率測試結果如表3所示。

表2 脂肪酶抑制活性篩選表

圖1 A1～A11餾分色譜圖

表3 組分A1～A11脂肪酶活抑制率表

由表3可知，A7的抑制率最高，達24.27%，進一步對該提取物進行梯度活性實驗篩選，測定其IC50值為（8.25±0.07） mg·mL-1。

3 結論與討論

3.1 結論

由不同酶篩選得到的小球藻多肽對于脂肪酶抑制率不同，其中采用1398中性蛋白酶所制得的小球藻多肽具有更高脂肪酶抑制活性，進一步對該多肽進行尺寸排阻色譜分離，發現不同部位活性不同，組分A7活性最高，其他組分對脂肪酶無抑制活性或抑制活性較弱。

3.2 討論

本研究通過不同酶篩選得到的小球藻多肽對脂肪酶抑制率不同。其中，中性蛋白酶水解法得到的小球藻多肽，分子量為600～700 Da的多肽對脂肪酶抑制效果良好，這可能與不同酶水解得到的多肽片段的種類、結構以及所暴露的活性位點不同有關，具體的作用機制還需進一步的相關藥理實驗研究。本文將小球藻以上述方式用1398中性蛋白酶水解，運用尺寸排阻色譜分離，收集分子量具有較高脂肪酶抑制活性部分，以此快速獲得具有較高脂肪酶抑制活性的小球藻多肽，該方法制得的小球藻多肽具有開發降脂活性功能產品的前景。