人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法研究*

陳 鳳,卿 玲,崔 璐，王 淼,王 菲

(1.中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院消化醫(yī)學(xué)中心,廣東深圳 518107；2.廣東省深圳市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 518112)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)是來源于中胚層的一類成體干細(xì)胞，因來源豐富、制備簡單、多能性、低免疫原性和致瘤性等特征越來越受到關(guān)注。MSC可以從機(jī)體的大部分組織器官如骨髓、脂肪、臍帶、胎盤、羊膜等組織中分離獲得[1-2]，具有多向分化潛能[3-4]、免疫調(diào)控[5]和促進(jìn)組織再生功能[6-7]，已成為全球開展臨床研究項目數(shù)量最多的細(xì)胞。目前來看，骨髓來源的MSC仍是臨床試驗(yàn)細(xì)胞的主要來源，但從骨髓中獲取干細(xì)胞的過程創(chuàng)傷大、大約每105～106個單核細(xì)胞中才有1個目標(biāo)細(xì)胞，加上隨著供體年齡增加，獲得細(xì)胞的數(shù)量、活力和分化能力均可能下降[8]。因此，尋找其他來源的種子細(xì)胞成為研究熱點(diǎn)。多項研究表明，胎盤組織可為干細(xì)胞開辟一個嶄新而豐富的來源，分離來自羊水、臍血、臍帶、羊膜、絨毛膜部位的細(xì)胞均表達(dá)MSC的特性，具有不同的可塑性和分化能力[9-10]；但什么方法最適合分離培養(yǎng)這些組織來源的干細(xì)胞尚無定論。目前分離培養(yǎng)MSC的方法各有利弊，從中篩選一種方便、高效的方法對提高干細(xì)胞體外制備效率具有重大意義。本研究選取人胎盤絨毛膜組織，分別采用組織塊貼壁法、胰酶多次反復(fù)消化法和膠原酶消化法進(jìn)行分離培養(yǎng)，比較不同培養(yǎng)方法獲得胎盤絨毛膜MSC(placental chorionic mesenchymal stem cells,PCMSC)的差異，并對不同方法獲得的細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行初步分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

人胎盤絨毛膜組織來源于廣東省深圳市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科行人工流產(chǎn)手術(shù)的健康孕婦。本研究已獲得廣東省深圳市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、成脂誘導(dǎo)分化試劑盒等均購自Gibco公司(美國)；Ⅰ型膠原酶購自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成；PE偶聯(lián)小鼠抗人CD34、CD44、CD45、CD105抗體均購自BD BIOSCIENCES PHARMINGEN公司(美國)；RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。完全培養(yǎng)基為添加10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1PCMSC的原代分離培養(yǎng)

由專業(yè)醫(yī)師剪取胎兒側(cè)的絨毛膜組織30 mL，經(jīng)生理鹽水沖洗，采用剪刀和鑷子去除組織塊中殘留的血絲，放入含1%青鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)中反復(fù)沖洗3次，將組織塊放入100 mm皿中，剪成1 cm左右長條塊，隨后剪碎至1 mm×1 mm×1 mm左右，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入適量PBS，800 r/min離心5 min，棄上清液。

1.2.1.1組織塊貼壁組

取10 mL組織塊均勻鋪于60 mm皿中，放入培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1 h；隨后加入適量完全培養(yǎng)基覆蓋組織塊，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.1.2Ⅰ型膠原酶消化組

取10 mL組織塊放入干凈的50 mL離心管中，加入0.1% Ⅰ型膠原酶溶液20 mL，于37 ℃水浴鍋放置1 h，每10分鐘搖晃離心管1次；1 h后將上述混合液體按每管15 mL分裝至2個50 mL離心管中分別加入30 mL完全培養(yǎng)基終止消化；將上述混合液經(jīng)100 μm細(xì)胞篩過濾去掉組織塊，過濾液800 r/min離心5 min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基重懸后轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.1.3胰蛋白酶消化組

取10 mL組織塊于干凈的50 mL離心管中，加入適量可覆蓋組織塊的0.25%胰蛋白酶溶液，于37 ℃水浴中消化15 min，將混合液體經(jīng)100 μm細(xì)胞篩過濾，過濾液中加入3倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化，組織塊中繼續(xù)加入0.25%胰蛋白酶溶液，重復(fù)上述過程2次；將收集到的過濾液800 r/min離心5 min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基重懸后轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。第2天進(jìn)行換液，盡量吸走漂浮的組織塊及懸浮在培養(yǎng)基中的血細(xì)胞，隨后每2天換液1次，待細(xì)胞局部匯合度達(dá)80%～90%時進(jìn)行傳代。

1.2.2細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測

取培養(yǎng)至第3代的細(xì)胞胰酶消化收集細(xì)胞，PBS重懸調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL細(xì)胞，取各管200 μL細(xì)胞懸液按照抗體使用說明書分別加入小鼠抗人CD34、CD44、CD45、CD105單克隆抗體，室溫下避光孵育0.5 h，PBS洗滌后重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)。

1.2.3細(xì)胞增殖能力測定

取培養(yǎng)至第4代細(xì)胞按1×104個/孔細(xì)胞分別接種至24孔板中，每天隨機(jī)取3孔細(xì)胞用胰酶消化，臺盼藍(lán)染色后用自動細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)，取其平均數(shù)繪制生長曲線。按公式[細(xì)胞群體倍增時間(PDT)=tlg2/(lgN-lgN0)]計算PDT。其中t為細(xì)胞培養(yǎng)時間，N0為細(xì)胞培養(yǎng)開始時的細(xì)胞數(shù)量，N為細(xì)胞培養(yǎng)終止時細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4多能性相關(guān)基因檢測

取培養(yǎng)至第5代細(xì)胞，按RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增檢測多能性相關(guān)基因——Oct4(上游引物5′-3′CCGAAAGAG AAAGCGAACCAG，下游引物5′-3′AT GTGGCTGATCTGCTGCAGT)、Nanog(上游引物5′-3′CAGAAGGCCTCAGCACCTAC，下游引物5′-3′CTGTTCCAGGCCTG ATTGTT)的表達(dá)，GAPDH為陽性對照(上游引物5′-3′CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC，下游引物5′-3′CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC)，引物序列參照文獻(xiàn)[11]。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72 ℃ 終延伸10 min；最后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5成脂分化檢測

取培養(yǎng)至第5代細(xì)胞以1×105個/孔接種到 6孔板中，待細(xì)胞融合約80%后,分化組加入成脂誘導(dǎo)分化液，對照組加入完全培養(yǎng)基，每3天換液1 次，分化組在第14天左右停止誘導(dǎo)。誘導(dǎo)結(jié)束后使用4%多聚甲醛室溫固定 30 min后進(jìn)行油紅O染色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 PCMSC的原代分離培養(yǎng)

不同方法分離培養(yǎng)形成的PCMSC見圖1。組織塊貼壁培養(yǎng)第6天部分組織塊周圍有少數(shù)細(xì)胞爬出，形態(tài)呈細(xì)小梭形，第12天左右局部細(xì)胞匯合度達(dá)90%，細(xì)胞排列緊密，呈漩渦狀生長。采用Ⅰ型膠原酶消化法原代細(xì)胞接種第3天可見大量的細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)為典型成纖維樣，以長梭形為主，有少量圓而亮的未貼壁細(xì)胞，第6天時細(xì)胞生長匯合度達(dá)90%，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用胰蛋白酶消化法原代細(xì)胞接種第3天可見少量的細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)以細(xì)小短梭形為主，經(jīng)第3天培養(yǎng)細(xì)胞量仍較少，第12天左右細(xì)胞匯合度達(dá)90%。

圖1 PCMSC的原代分離培養(yǎng)(40×)

2.2 獲得PCMSC的活細(xì)胞數(shù)量

采用膠原酶消化法獲得的活細(xì)胞數(shù)量均明顯高于組織塊貼壁法和胰蛋白酶消化法，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；組織塊貼壁法與胰蛋白酶消化法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

a：P<0.05，與膠原酶消化法比較。圖2 3種方法分離培養(yǎng)PCMSC的活細(xì)胞數(shù)量比較

2.3 細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)

3種方法分離培養(yǎng)的細(xì)胞均高表達(dá)MSC表面標(biāo)志物——CD44、CD105，低表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志物——CD34、CD45。與組織塊貼壁和膠原酶消化法獲得的細(xì)胞比較，來源于胰蛋白酶消化的部分細(xì)胞呈CD34、CD44、CD45、CD105陰性，見圖3。

圖3 PCMSC表面標(biāo)志物表達(dá)

2.4 細(xì)胞增殖能力

3種方法分離培養(yǎng)的PCMSC生長曲線均呈“S”形，1～2 d為細(xì)胞生長潛伏期，增殖不明顯，2～5 d細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，增殖速度加快，6～7 d細(xì)胞進(jìn)入平臺期，增殖緩慢，見圖4A。3種方法獲得的細(xì)胞PDT分別為1.90、1.86、1.85 d。3組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4B。

A：PCMSC生長曲線；B：PDT。圖4 PCMSC的增殖能力

2.5 多能性相關(guān)基因表達(dá)

3種方法分離培養(yǎng)獲得的PCMSC均表達(dá)Oct4、Nanog，見圖5。

1：組織塊貼壁法；2：膠原酶消化法；3：胰酶消化法；4：陰性對照。圖5 PCMSC的多能性相關(guān)基因表達(dá)

2.6 成脂分化能力

3種方法分離培養(yǎng)來源的細(xì)胞在誘導(dǎo)前5 d細(xì)胞形態(tài)均無明顯變化，誘導(dǎo)第7天開始部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞體積增大，可見少量小脂滴于胞漿中，誘導(dǎo)10 d左右含脂滴細(xì)胞數(shù)量明顯增多，未加誘導(dǎo)分化液的對照組細(xì)胞堆積生長，但細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，也未見脂滴生成，取第14天細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色脂滴為紅色，見圖6。

圖6 PCMSC誘導(dǎo)分化過程(100×)

3 討 論

胎盤絨毛膜的大部分組織起源于胚外中胚層，其中富含大量MSC，是再生醫(yī)學(xué)重要的干細(xì)胞來源。目前，胎盤MSC的研究尚處于初級階段，其分離純化及鑒定尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，仍需進(jìn)一步探索。

分離培養(yǎng)MSC的方法多種多樣，不同的分離方法可能會特異性選擇某一亞群細(xì)胞，導(dǎo)致獲得的細(xì)胞具有差異性[12]。目前，主要的分離方法有酶消化法和組織塊貼壁法，各種分離方法均有利弊，但很少有研究在PCMSC的分離培養(yǎng)中對其進(jìn)行比較。本研究采用組織塊貼壁法、胰酶消化法、膠原酶消化法均可獲得PCMSC，采用膠原酶消化法在第3天即可見大量細(xì)胞貼壁生長，相比組織塊貼壁法和胰酶消化法需要的原代培養(yǎng)時間更短。相同體積的絨毛膜組織在分離培養(yǎng)相同時間內(nèi)膠原酶消化組獲得的活細(xì)胞數(shù)量明顯高于組織塊貼壁法和胰酶消化法，與近年來一篇文獻(xiàn)報道的結(jié)果類似，其發(fā)現(xiàn)采用膠原酶消化法獲得羊膜MSC的數(shù)量明顯高于胰酶消化法[13]。

MSC具有獨(dú)特的細(xì)胞表型，本研究采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，3種分離方法獲得的細(xì)胞均表達(dá)MSC表面標(biāo)志物——CD44、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞——CD34、CD45這些造血干細(xì)胞標(biāo)志物，與文獻(xiàn)報道的MSC表面標(biāo)志物相同[14-16]。值得注意的是，來源于胰酶消化的部分細(xì)胞均不表達(dá)以上標(biāo)志物，表明存在非MSC和非造血細(xì)胞的亞群細(xì)胞，可能為一些內(nèi)皮細(xì)胞或特殊滋養(yǎng)層細(xì)胞[17]。3種分離方法獲得的第4代細(xì)胞進(jìn)入潛伏期、對數(shù)生長期、平臺期的各時間點(diǎn)均接近，群體倍增時間無明顯差異，表明增殖能力無明顯差異，但隨著傳代時間的延長，其增殖能力是否會發(fā)生變化尚需進(jìn)一步研究。

Oct4、Nanog等基因通常用于評判干細(xì)胞是否具有多能性，本研究結(jié)果顯示，3種方法獲得的細(xì)胞均表達(dá)Oct4、Nanog，表明獲得的細(xì)胞具有多能性，但僅從聚合酶鏈反應(yīng)檢測結(jié)果來看，胰酶消化法表達(dá)量弱于膠原酶消化法和胰酶消化法，是否與獲得的細(xì)胞中含有其他類型的細(xì)胞有關(guān)尚有待于研究。胎盤PCMSC經(jīng)成脂誘導(dǎo)后均在胞漿中形成了脂滴，染色鑒定顯示其具有成脂分化潛能。

綜上所述，采用組織塊貼壁法、膠原酶消化法、胰酶消化法分離獲得的細(xì)胞均表達(dá)MSC表面標(biāo)志物——CD44、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物——CD34、CD45，表達(dá)Oct4、Nanog基因且具有成脂分化潛能，表明其具有MSC的生物學(xué)特性。就PCMSC的培養(yǎng)而言，膠原酶消化法具有明顯優(yōu)勢，不僅所需的原代培養(yǎng)時間最少，而且不容易被污染，培養(yǎng)純度和成功率更高，可大規(guī)模培養(yǎng)。