上皮間充質轉化介導慢性阻塞性肺疾病的研究進展*

張慶柳 綜述，趙 偉，管思彬 審校

(同濟大學附屬東方醫院心衰專科，上海 200120)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續性氣流受限為特征的常見慢性氣道炎癥性疾病，具有很高的致死、致殘率，已成為嚴重的全球性公共衛生問題[1]。流行病學調查顯示，2017年我國COPD現患人群約1億，COPD已成為我國第四大致死疾病，給患者家庭和社會均帶來了沉重的經濟負擔[2]。

氣道重塑是COPD的重要病理生理改變，主要發生在直徑小于2 mm的小氣道內，表現為氣道和肺對有害顆粒和氣體炎性反應增加，異常修復與損傷持續進行，上皮杯狀細胞增生，基底膜增厚，膠原、纖維連接蛋白等細胞外基質(extracellular matrix，ECM)沉積增加，最終導致小氣道纖維化、氣道狹窄、阻力增加。雖然目前的藥物治療、肺康復治療及外科肺減容手術等臨床治療手段在一定程度上可改善患者癥狀，但難以逆轉氣道重塑的進展。近年來，有研究表明，上皮間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)在COPD氣道重塑的發生、發展中扮演重要角色[3]；深入研究EMT在COPD氣道重塑中的特征和機制，尋找潛在干預靶點已成為研究熱點。

1 EMT概念

EMT是指上皮細胞在生理和(或)病理條件下經歷多種生物化學改變最終獲得間質細胞特性的過程，表現為細胞緊密連接和黏附性下降或消失，細胞極性丟失，遷移和運動能力增強，獲得穿透基底膜的潛能，侵襲進入固有層[4]。在EMT過程中，上皮細胞標志物——E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)、緊密連接蛋白1(zonula occludens，ZO-1)等表達降低，同時間質標志物表達增加，包括α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白、N-鈣黏蛋白(N-cadherin，N-cad)、纖維連接蛋白(fbronectin,FN)等[5]。

根據發生的背景及生物學行為和標志物的不同，EMT可分為3型，Ⅰ型EMT主要與胚胎發育和器官形成相關；Ⅱ型EMT主要參與創傷愈合、組織再生和器官纖維化過程；Ⅲ型EMT與異常增強的血管發生有關，參與上皮細胞來源的惡性腫瘤侵襲和轉移。這3種類型EMT的轉歸是相同的，即上皮細胞發生極化，獲得間質細胞的特性。但與Ⅰ、Ⅲ型EMT明顯不同的是，Ⅱ型EMT的始動因素主要是炎癥和損傷[6]。在持續性炎癥和損傷作用下上皮細胞失去E-cad等標志物，脫離黏膜層，進入受損基底膜并遷移至間質組織，獲得間質細胞表型，分泌大量ECM，導致纖維化的發生。

2 EMT參與COPD的氣道重塑

香煙煙霧等有害氣體/顆粒引發氣道氧化應激和持續性炎癥，誘導氣道上皮組織屏障功能下降并發生EMT[7]，向成纖維細胞/肌成纖維細胞分化。轉分化的上皮細胞間黏附力下降，細胞骨架蛋白構成改變、遷移能力增加，進一步激活相關信號通路，引發ECM過度沉積，上皮周圍纖維化，加劇COPD小氣道內實質結構的破壞和氣流受限，最終導致氣道重塑進行性發展[8]。

MILARA等[9]通過分離了COPD患者小氣道原代細胞，并與對照組比較，結果顯示，上皮細胞標志物——E-cad、ZO-1、細胞角蛋白5表達均明顯降低，而間質標志物——α-SMA、波形蛋白、CollagenⅠ表達均明顯增高。有研究也發現，COPD大鼠氣道纖維化程度明顯增高，E-cad表達降低，α-SMA表達增加[10]。進一步體外研究證實，在香煙煙霧刺激下，鵝卵石狀排列的支氣管上皮細胞分化為梭樣的間質細胞形態，同樣檢測到E-cad表達降低，而間質標志物——α-SMA表達增高。通過對小氣道上皮細胞緊密連接的基因芯片的研究發現，在肺功能正常的吸煙者和COPD患者氣道內均存在E-cad向N-cad轉化，而這種鈣黏蛋白的轉換不僅早于臨床癥狀的出現，也是發生EMT的重要標志[11]。此外，在COPD患者肺內也觀察到內皮細胞-間充質細胞轉化，提示氣道纖維化可能存在多重間質細胞來源[12]。

總之，在吸煙者特別是吸煙的COPD患者氣道內存在明顯EMT的激活，EMT是COPD小氣道增厚和纖維化的重要因素。肺功能正常的吸煙者氣道內EMT的出現，提示EMT可能是香煙煙霧誘導的氣道早期病理改變[13]。

3 EMT在COPD氣道中的作用機制

氣道上皮細胞受生長因子、炎性細胞因子、缺氧等不同信號分子刺激后相關信號通路被激活，激活下游各級轉錄因子參與EMT過程，影響其增殖、遷移及分泌等生物學行為。

3.1 轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路

TGF-β是一種多功能多肽類細胞因子，在器官發育、組織修復、炎癥、細胞增殖及分化等方面均發揮著重要作用。TGF-β尤其是TGF-β1被認為是促使多種上皮組織發生EMT的“開關因子”。多項研究發現，COPD患者血清、支氣管肺泡灌洗液及肺組織中TGF-β1表達均明顯增高[14-16]。TGF-β1首先與TGF-β受體2(TGF-β receptor 2，TGF-βR2)結合并發生構象變化，并被TGF-βR1識別結合形成三聚體，三聚體中TGF-βR1被TGF-βR2磷酸化，進一步活化細胞內下游信號傳導分子——Smad2，磷酸化的Smad2(pSmad2)與Smad3形成同源寡聚體，再與Smad4結合形成異源寡聚體轉入核內，與不同的DNA結合蛋白協同激活下游轉錄因子，如鋅指E盒結合蛋白(zinc finger E-box binding homeobox，ZEB)1、ZEB2、Snail、Slug等，進而抑制E-cad、ZO-1等緊密連接蛋白表達，上調α-SMA等靶基因表達，促進EMT的發生[17]。體外TGF-β1刺激肺上皮細胞48 h后，原本呈鵝卵石排列的細胞呈現間質細胞形態，細胞間隙增加，E-cad表達明顯下降，N-cad、α-SMA表達均增加，且與TGF-βR2、TGF-βR1、pSmad2、pSmad3上調呈正相關[18]。體外研究證實，應用TGF-βR1抑制劑——SB431542或利用小干擾RNA沉默Smad2可拮抗氣道上皮細胞EMT過程，增加E-cad表達，降低α-SMA、N-cad、波形蛋白、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)表達[19-20]。表明抑制TGF-β/Smad通路有助于減輕EMT，改善COPD氣道重塑的發展。除Smad信號通路外，TGF-β1還通過激活絲裂原活化蛋白激酶通路，如細胞外調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p38、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK) 家族等促進EMT的發生[21]。YANG等[22]研究發現，TGF-β1體外刺激肺上皮細胞后ERK、p38磷酸化水平均明顯增高，分別抑制ERK、p38后可調節下游E-cad，使其表達增加，并降低α-SMA、波形蛋白、纖維連接蛋白表達，抑制細胞遷移，減輕EMT。

3.2 Wnt/β-聯蛋白(β-catenin)通路

Wnt是一種分泌性糖蛋白，與其膜受體——卷曲蛋白受體結合后作用于細胞內Dishevelled蛋白，抑制糖原合成酶激酶-3活性和細胞質中β-catenin的降解，使β-catenin在胞質內蓄積增加，進入細胞核內，與轉錄因子淋巴樣增強子形成復合物，激活下游目的基因——c-myc、細胞周期蛋白D1等表達誘發EMT[23-24]。體外用尼古丁刺激人支氣管上皮細胞24 h后檢測到Wnt3a表達明顯增高，且呈尼古丁劑量依賴改變，進而促使β-catenin核轉位增加，激活下游基因，增加α-SMA、波形蛋白、MMP-9、Ⅰ型膠原蛋白表達，降低E-cad水平，進一步靶向阻斷Wnt/β-catenin通路可，逆轉尼古丁誘導的EMT[25]。

3.3 磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素蛋白(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/ mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)通路

PI3K具有異二聚體結構，活化的PI3K二聚體構象變化，磷酸化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2)轉化為磷脂酰肌醇4,5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate，PIP3)，PIP3與細胞內信號蛋白——Akt、3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)結合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白的Ser308，活化的Akt進一步激活下游靶點——mTOR，調控下游靶基因表達，在細胞增殖、分化、凋亡、極性轉化中發揮重要作用。有研究表明，PI3K/Akt/mTOR通路不僅促進炎癥細胞的激活，也參與了對COPD氣道重塑的調節[26-27]。CHEN等[28]用脂多糖體外誘導支氣管上皮細胞發生EMT，結果顯示，p-Akt、p-mTOR蛋白表達明顯上調，繼續以PI3K/Akt通路抑制劑——Ly294002干預可上調E-cad水平并降低波形蛋白、α-SMA、MMP-2、MMP-9、纖維連接蛋白表達，抑制EMT的發生。

3.4 多種微小RNA(micro RNA，miRNA)參與了EMT的調節

miRNA是一類由19～24個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區結合形成沉默復合體，抑制其翻譯或促進其降解，從而達到調控相關蛋白表達的作用。近年來，大量研究表明，miRNA參與了氣道EMT的反饋調節，如miR-29b在COPD患者體內表達下調，影響細胞周期；體外研究表明，miR-29b可通過作用于一些多功能轉錄因子調節肺上皮細胞增殖、遷移，并抑制其間質標志物表達[29-30]。miR-200b-3p通過下調鋅指蛋白532、ZEB2表達，抑制TGF-β1誘導的支氣管上皮細胞EMT的發生[31]。有研究發現，COPD小鼠肺組織miR-515-5p表達明顯降低；進一步體外試驗證實，外源性增加miR-515-5p可降低香煙煙霧提取物誘導的支氣管上皮細胞間質標志物的表達，并上調E-cad水平，這一過程與miR-515-5p直接負反饋調節轉錄因子叉頭框蛋白C1/Snail有關[32]。miRNA種類多，作用機制紛繁復雜，一種miRNA可通過多重機制調控機體功能，一種病理過程也可能受到多種miRNA的協同調控，COPD是多基因介導的疾病，未來需要更大樣本的臨床隨機對照試驗和更深入的基礎研究驗證。

4 小結與展望

香煙煙霧無疑是導致吸煙者肺內EMT的重要“驅動力”，但戒煙本身并不能逆轉氣道中已出現的EMT，即使失去了最初的誘導刺激，EMT依然可通過一種自我延續的方式繼續進展[33-35]。EMT的終止受哪些因素控制、何種因子啟動了非吸煙COPD人群的EMT過程、COPD中EMT的具體調控機制等仍有許多未解之謎，多個信號通路的交叉協同促進了EMT的發生和進展。對于COPD而言，關鍵在于早期預防，EMT為COPD的治療開辟了新的領域，更深入、更系統的探究EMT在COPD氣道重塑中的具體作用機制，尋找關鍵靶點，對COPD的精準預防與治療具有十分重要的意義。