基于NF-κB信號通路Hp感染對胃癌小鼠炎癥因子釋放的促進作用*

賈純亮，梁 磊，張 磊，李翰嵩，王 劍，劉遠廷

(河北省唐山市人民醫院胃腸外科 063000)

胃癌是臨床常見惡性腫瘤，嚴重威脅患者生命安全，晚期患者中位生存期不到12個月，因此，早期預防和治療至關重要。許多因素均可影響胃癌的進展，包括遺傳和環境因素等，微生物作為腫瘤環境的一部分，在胃癌發生、發展和轉移過程中發揮著重要作用，胃癌的發生、發展與微生物結構變化高度相關[1]。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種革蘭陰性微需氧菌，定植于胃黏膜，是慢性胃炎及消化道潰瘍的主要發病原因，感染后可直接作用于胃黏膜和上皮細胞，破壞胃黏膜細胞屏障，引起胃炎，之后演變為慢性活動性胃炎，持續感染Hp可觸發炎癥級聯反應，增加發生胃癌的風險[2]。Hp感染的流行程度與地區、種族及社會經濟地位不同有關，各年齡段人群均可感染，發展中國家感染率更高。據文獻報道，Hp定植率超過50%，就很難自行消除，導致終身感染，1%～3%的感染者會發展成為胃癌，根除Hp可有效降低胃癌發生率。目前尚缺乏徹底、有效清除Hp的方法，因此，深入研究其感染機制，對清除Hp具有重要意義[3]。核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是調控基因轉錄的重要因子，參與機體炎性反應及免疫應答等多種病理生理過程，其過度表達與多種慢性炎癥性疾病及腫瘤發病機制相關[4-5]。炎性反應和慢性感染可提高胃癌發病率，Hp持續感染后NF-κB呈激活狀態，并介導炎癥級聯反應[6]。YANG等[7]研究表明，Hp感染誘導的慢性炎癥和胃癌與NF-κB有關。目前，關于Hp感染引起胃黏膜炎癥的發病機制尚不十分明確，本研究探討NF-κB通路在Hp長期感染小鼠致胃癌中的作用，并從慢性炎癥角度探討Hp長期感染導致胃癌的可能機制，以期為臨床治療提供靶點和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：Hp悉尼株(含vacA和cagA基因)，購自美國模式培養物集存庫。實驗動物：無特定病原體(SPF)級雄性C57BL/C小鼠160只，6周齡，平均體重(20±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2017-0011]，購入后于23～25 ℃、相對濕度50%～70%、明暗交替12 h/12 h、清潔通風環境中適應性飼養7 d。主要試劑：哥倫比亞瓊脂培養基購自英國Oxoid公司；Hp檢測試劑盒購自上海通蔚生物科技公司；小鼠白細胞介素-18(interleukin-18，IL-18)、IL-10、γ-干擾素(interferon factor-γ，IFN-γ)酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、兔抗小鼠核苷酸結合寡聚化結構域1(nucleotide-binding oligomerization domain 1，NOD1)、受體相互作用蛋白2(receptor interacting protein 2，RIP2)、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(phosphorylation，p-NF-κB p65)一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1菌株培養

Hp菌株于37 ℃水浴復蘇，接種于哥倫比亞瓊脂培養基，在微需氧環境(5% 氧氣，10%二氧化碳，85%氮氣)中，濕度大于或等于95%，37 ℃恒溫培養72 h。

1.2.2Hp菌株感染小鼠模型

將培養基中的Hp菌株刮下，鑒定后與磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)混合，檢測菌液濃度，調整至1×109菌落形成單位/mL備用。實驗前所有小鼠禁食12 h，禁飲4 h。將160只小鼠分為模型組和對照組，每組80只，模型組小鼠給予Hp菌液灌胃，每只1 mL，每48 小時灌胃1次，連續灌胃5次；對照組小鼠給予等體積PBS灌胃，干預頻次與模型組相同。所有小鼠灌胃后禁食、禁飲4 h。

1.2.3組織取材

分別于最后1次灌胃結束后18、36、54、72周，兩組均取20只小鼠，摘除眼球取血，保存于抗凝管中。開腹取胃，觀察胃部大體形態之后分離胃黏膜組織，分為3份，1份用于Hp檢測，1份用4%多聚甲醛固定，用于病理組織學觀察，1份保存于液氮中，用于 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)和Western blot檢測。

1.2.4ELISA檢測血清IL-18、IFN-γ、IL-10水平

取小鼠全血，3 000 r/min離心5 min，留上清液，按ELISA試劑盒說明書操作，加樣37 ℃孵育30 min，用PBS洗滌；加入一抗工作液37 ℃孵育60 min，用PBS洗滌；加入酶標抗體工作液37 ℃孵育60 min，用PBS洗滌；顯色，終止反應后，450 nm波長處讀取吸光度值，根據標準曲線計算血清樣品中IL-18、IFN-γ、IL-10水平。

1.2.5Hp檢測

應用快速尿素酶試驗，采用Hp檢測試劑盒將胃黏膜組織放入其中，30 min變為紫紅色或紅色則判定為陽性。Giemsa染色，取在4%多聚甲醛中固定的胃黏膜，液體石蠟包埋后連續切片，片厚約4 μm，二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇脫水，2% Giemsa染色30 min，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察，Hp菌體呈藍色表示陽性。快速尿素酶試驗和Giemsa染色二者均為陽性表示Hp感染。

1.2.6蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色觀察胃黏膜病理學變化

取胃黏膜組織切片，二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇脫水，常規HE染色，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。胃黏膜病理改變判定標準[8]：(1)慢性胃炎，淋巴細胞、嗜酸粒細胞和中性粒細胞浸潤；(2)萎縮性胃炎，胃黏膜固有層幽門腺或胃底腺萎縮、減少或消失，伴(不伴)炎性細胞浸潤，黏膜肌增厚，肌纖維伸向固有層；(3)腸化生，萎縮的胃黏膜腺體被腸腺代替；(4)異型增生，包括胃黏膜上皮細胞形態改變和腺體結構異型性；(5)胃腺癌，腺體增生明顯，細胞間異型性明顯，基底膜破壞，腺上皮浸潤。所有組織切片采取盲法由專人讀片。參照MIYASHITA等[9]的方法對黏膜炎癥情況進行評分，0分為無明顯病理損傷，5分為出現嚴重損傷，評分越高表示炎癥損傷越嚴重。

1.2.7qRT-PCR檢測胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達

取液氮中保存的胃黏膜組織，Trizol法提取總RNA，檢測濃度和純度，逆轉錄合成cDNA，進行qRT-PCR檢測。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。配制反應體系：模板cDNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10 μL，加雙蒸水至總體積25 μL。反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環。以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCT法計算NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA相對表達水平。

表1 引物序列

1.2.8Western blot法檢測胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達

取液氮中保存的胃黏膜組織，加入RIPA裂解液，冰上勻漿，12 000 r/min離心30 min，取上清液，采用蛋白質定量(BCA)法進行蛋白定量，100 ℃水浴蛋白變性，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳法進行電泳，轉至PVDF膜，加入封閉液后搖床室溫封閉2 h。將PVDF膜加入稀釋的NOD1(1∶500)、RIP2(1∶500)、NF-κB p65(1∶800)、p-NF-κB p65(1∶800)一抗中4 ℃過夜，洗膜，加入相應二抗(1∶2 000)，室溫封閉1 h，洗膜。加入電化學發光液，曝光、拍照，采用Image J軟件分析條帶灰度值。計算目的蛋白相對表達水平(目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值)。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 血清IL-18、IFN-γ和IL-10水平

模型組小鼠18、36、54、72周血清IL-18、IFN-γ水平均明顯高于對照組，IL-10水平均明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。對照組小鼠各時間點血清IL-18、IFN-γ、IL-10水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；模型組小鼠血清IL-18、IFN-γ水平隨時間延長而升高，IL-10隨時間延長而降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

A：IL-18水平；B：IFN-γ水平；C：IL-10水平；a：P<0.05，與同組18周比較；b：P<0.05，與同組36周比較；c：P<0.05，與同組54周比較；d：P<0.05，與對照組同時間點比較。圖1 各組小鼠不同時間點血清IL-18、IFN-γ、IL-10水平比較

2.2 胃黏膜Hp定植情況

對照組小鼠各時間點胃黏膜尿素酶試驗及Giemsa染色均為陰性，無Hp感染；模型組小鼠18、36、54、72周胃黏膜快速尿素酶試驗及Giemsa染色均為陽性，Hp定植率為100%。

2.3 胃大體情況

對照組小鼠胃黏膜表面光滑，色澤均勻，呈淡紅色，無充血、水腫、潰瘍等明顯病變。模型組小鼠18周時出現散在出血灶，水腫，顏色加深；36周時出現條索狀出血灶，廣泛水腫，呈紅色，部分出現糜爛、潰瘍，胃黏膜發生萎縮；54周時出血灶增加，多處潰瘍，胃黏膜表面發白，出現腸化生；72周時胃黏膜受損程度加重，胃黏膜潰瘍，重度糜爛，黏膜增厚，見圖2。

A：對照組；B：模型組18周；C：模型組36周；D：模型組54周；E：模型組72周。圖2 各組小鼠胃大體情況

2.4 胃黏膜病理變化情況

對照組小鼠胃黏膜上皮細胞排列整齊，結構正常，無明顯病變；模型組小鼠18周時出現明顯中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，存在炎性反應；36周時炎癥進一步加重，淋巴細胞大量浸潤，出現萎縮性胃炎；54周時出現異型增生及腸化生等癌前病理表現；72周時胃黏膜以慢性胃炎為主，并出現萎縮性胃炎、異型增生、腸化生及腺癌，20只小鼠全部有慢性胃炎表現，發生率為100%，18只小鼠出現萎縮性胃炎，發生率為90%，15只小鼠出現腸化生，發生率為75%，10只小鼠出現異型增生，發生率為50%，7只小鼠出現胃腺癌，發生率為35%。對照組小鼠無炎性反應，模型組小鼠18、36、54、72周炎癥評分分別為(2.03±0.32)、(2.98±0.35)、(3.67±0.41)、(4.36±0.46)分，炎癥評分隨時間延長逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

A：正常胃黏膜；B：胃黏膜發生炎癥；C：胃黏膜發生萎縮；D：胃黏膜發生腸化生；E：胃黏膜發生異型增生；F：胃黏膜腺癌。圖3 胃黏膜病理變化情況(HE，200×)

2.5 胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達水平

模型組小鼠18、36、54、72周胃黏膜NOD1、RIP2 mRNA相對表達水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。對照組小鼠各時間點胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA相對表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；模型組小鼠胃黏膜NOD1、RIP2 mRNA相對表達水平隨時間延長而升高，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組小鼠各時間點NF-κB p65 mRNA相對表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

A：NOD1 mRNA表達；B：RIP2 mRNA表達；C：NF-κB p65 mRNA表達；a：P<0.05，與同組18周比較；b：P<0.05，與同組36周比較；c：P<0.05，與同組54周比較；d：P<0.05，與對照組同時間點比較。圖4 各組小鼠不同時間點胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表達水平比較

2.6 胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平

模型組小鼠18、36、54、72周胃黏膜NOD1、RIP2、p-NF-κB p65蛋白相對表達水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。對照組小鼠各時間點胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；模型組小鼠胃黏膜NOD1、RIP2、p-NF-κB p65蛋白相對表達水平隨時間延長而升高，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組小鼠各時間點NF-κB p65蛋白相對表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5、6。

圖5 各組小鼠不同時間點胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達電泳圖

A：NOD1蛋白表達；B：RIP2蛋白表達；C：NF-κB p65蛋白表達；D：p-NF-κB p65蛋白表達；a：P<0.05，與同組18周比較；b：P<0.05，與同組36周比較；c：P<0.05，與同組54周比較；d：P<0.05，與對照組同時間點比較。圖6 各組小鼠不同時間點胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平比較

3 討 論

大量微生物構成重要的微生態系統，在維持人體健康方面發揮著復雜作用。人體胃腸道中存在多種微生物菌群，可能導致癌癥在內的多種疾病的發生，已經證實，微生物菌群是影響結直腸癌、口腔鱗狀細胞癌等的關鍵環境因素[10-11]。Hp是引起消化道潰瘍、慢性胃炎、消化系統腫瘤的重要病原微生物，被WHO列為胃癌的Ⅰ類致癌物[12-14]。流行病學研究顯示，胃癌可發生于Hp感染的胃黏膜，而無Hp感染的胃黏膜不發生胃癌[15]。盡管多項研究證實胃癌與Hp感染有關，但其具體機制仍不十分清楚，通過建立Hp感染動物模型研究相關機制，對降低胃炎及胃癌發病率至關重要。

胃癌患者中約有90%的非賁門區胃癌病例與Hp感染有關，Hp感染引起胃腺癌的過程為胃炎、萎縮、腸化生、異型增生、癌，Hp感染引起胃底黏膜發生炎性反應，造成胃黏膜萎縮和腸化生，導致胃黏膜異型增生，最終引起分化型腺癌，伴Hp感染的慢性胃炎及萎縮性胃炎等病理改變的人群發生胃癌的風險更高[16-17]。本研究采用多次高濃度Hp連續攻擊小鼠，對照組小鼠各時間點Hp均為陰性，模型組小鼠各時間點均有Hp檢出，表示建模成功，連續飼養72周小鼠胃黏膜顯示，從正常至慢性胃炎、萎縮性胃炎、腸化生、異型增生及胃腺癌的病理過程，胃癌發生率為35%，證實長期慢性Hp感染可導致胃癌。Hp感染發病機制包括自身毒力因子作用、誘發機體炎癥和免疫反應及宿主因素三方面，其誘發的炎性反應以淋巴細胞等浸潤胃黏膜為特征，多種細胞因子在炎癥細胞激活和趨化過程中發揮了重要作用，通過釋放大量活性物質形成級聯炎癥效應，造成組織損傷。IL-18是一種中性粒細胞趨化因子，主要來源于胃黏膜上皮細胞，Hp入侵后促進IL-18大量分泌，引起黏膜局部炎性反應，產生潰瘍[18]。Hp定植于胃黏膜，抗原持續刺激可誘發局部特異性免疫反應。有研究表明，Hp感染后胃黏膜以Th1型免疫應答為主，通過分泌IFN-γ等細胞因子，對胃黏膜造成損傷[19]。IL-10為抑炎性細胞因子，可抑制多種炎癥介質的釋放，減輕炎性反應。本研究結果顯示，模型組小鼠各時間點血清IL-18、IFN-γ水平均明顯高于對照組，且隨時間延長逐漸升高，而IL-10水平明顯低于對照組，且呈逐漸下降趨勢，同時胃黏膜損傷進一步加重，提示Hp感染引起的炎癥與IL-18、IFN-γ、IL-10等炎性細胞因子水平失衡有關。

胃癌發病機制復雜，與多基因、多通路異常有關，其中細胞內信號傳導通路失調是其重要的發病機制之一，致癌物質的入侵及炎癥因子通過活化細胞生存信號促進腫瘤形成。NF-κB常以p50/p65二聚體存在于細胞中，NF-κB p65異常活化參與了多種細胞因子、趨化因子、生長因子的轉錄調節，與胃癌發生、發展密切相關。NOD1通過識別細菌細胞壁肽聚糖結構，激活下游RIP2，進而活化NF-κB等信號通路，誘導IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子的表達和分泌，引起一系列免疫應答反應[20]。Hp感染后可與NOD1結合，活化NF-κB，調節各種炎癥因子、趨化因子及生長因子的表達，參與細胞增殖、分化、凋亡等過程，通過改變細胞間黏附能力促進上皮間質轉化及誘導基因突變等，在炎癥及腫瘤形成過程中發揮了重要作用[21-22]。本研究結果顯示，模型組小鼠各時間點NOD1、RIP2 mRNA和蛋白及p-NF-κB p65蛋白表達均明顯升高，且隨時間延長逐漸升高，與胃黏膜病理嚴重程度趨勢一致，提示NF-κB通路在Hp感染小鼠模型中被激活，參與炎性反應，與胃黏膜損傷有關。

本研究證實，NF-κB通路在Hp感染小鼠胃癌模型中被激活，并可促進炎癥因子分泌，進而損傷胃黏膜。鑒于NF-κB通路活化對胃癌發生的促進作用，可假設NF-κB作為治療靶點，為臨床靶向治療提供依據，但具體研究結論尚有待于進一步證實。