降鈣素基因相關肽對高氧肺損傷的Notch通路調控*

鄧 健，王少華

(廣東省深圳市福田區婦幼保健院兒科 518045)

氧療是臨床常用手段，但當早產兒肺組織長時間接受高氧時反而會引起高氧肺損傷，對其預后造成不同程度的影響[1]。降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP) 為一類主要由感覺神經釋放的生物活性神經肽類物質[2]。Notch通路是一條參與體內多種器官和組織調控的信號通路[3]。近年來，相關研究表明，CGRP和Notch通路均參與了肺損傷修復重建過程[4-5]。然而，對CGRP是否通過Notch通路調控高氧肺損傷的修復，目前國內相關研究仍較匱乏。本研究以SD早產鼠及其肺組織作為研究對象，通過比較在高氧暴露的不同時間點使用CGRP及其拮抗劑、Notch信號通路阻斷劑干預后肺組織的病理改變，以及其中Notch信號的Notch l、Hes、heRP mRNA表達情況，以探討CGRP是否通過調控Notch通路對肺組織發揮效應，從而為高氧肺損傷的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及分組

每天下午將健康SD成年雄鼠和雌鼠(由深圳市拓普生物科技有限公司實驗室購置)按1∶1比例合籠交配，次日清晨檢查到雌鼠陰道涂片顯示精子者定義為妊娠第0天。雌鼠妊娠第19天用乙醚麻醉后剖宮產取出胎仔作為研究對象。將胎齡19 d的SD早產鼠分為空氣組(A組)、高氧組(B組)、高氧聯合CGRP組(C組)、高氧和CGRP聯合CGRP8-37組(D組)及高氧和CGRP聯合MW167組(E組)，每組至少18只，依次編為A～E組。CGRP8-37為CGRP拮抗劑，MW167為Notch信號通路阻斷劑。

1.1.2主要試劑與儀器

主要試劑與儀器為CGRP(ANASPEC)、CGRP8-37 (Wurogentec)、MW167(millipore)、Notch-1 (ABclonal)、heRP(Biobyt)、Hes(Santa)、反轉錄試劑盒(全式金)、蘇木精-伊紅染色(hematoxylin eosin，HE)染色液(Servicebio)、熒光倒置顯微鏡(Mshot)等。

1.2 方法

1.2.1制備動物模型

參照梁木林等[6]介紹的方法制備高氧動物模型。同時對各組早產鼠腹腔注射干預試劑，A、B組均為生理鹽水，C～E組分別為CGRP、CGRP聯合CGRP8-37、CGRP聯合MW167。注射完畢后約1 h將早產鼠給近期正常分娩的母鼠哺乳。除A組外，B～E組代乳鼠和未成熟鼠均放置在95%高氧容器中，定時添增水和飼料，持續14 d 。

1.2.2肺組織標本制備及病理檢查

哺乳期第3、7、14 天每組處死6只早產鼠并取出肺組織保存于-80 ℃液氮快速冷凍。常規切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。采用BAUMAN等[7]介紹的肺組織損傷評分法評估其病理改變。

1.2.3定量實時聚合酶鏈反應(Q-PCR)法檢測肺組織 Notch 1、Hes、heRP mRNA表達水平

提取總RNA逆轉錄合成cDNA進行擴增。反應條件:95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s,60 ℃退火延伸34 s，共40個循環。

1.3 統計學處理

2 結 果

2．1 肺組織病理改變

A組早產鼠肺組織氣管、血管正常。B、D、E組早產鼠第3天可見炎癥細胞浸潤；第7天可見肺泡上皮細胞腫脹，間質水腫；第14天氣管、血管廣泛破壞，管壁增厚。C組早產鼠第3天大致正常，第7天肺泡間隔少許斷裂，第14天肺泡融合，肺泡內充滿滲出液，見圖1。

圖1 各組早產鼠不同時間點肺組織病理改變比較(HE染色，200×)

2.2 肺損傷病理評分

C組早產鼠第3、7、14天肺損傷病理評分均低于B、D、E組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組早產鼠不同時間點肺損傷病理評分比較分)

2．3 肺組織Notch 1、Hes、heRP mRNA表達水平

C組早產鼠第3、7、14天Notch 1、Hes、heRP mRNA表達水平均明顯高于B、D、E組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組早產鼠不同時間點肺組織Notch 1、Hes、heRP mRNA表達水平比較

3 討 論

CGRP由37 個氨基酸組成，是人類用分子生物學方法發現的第1個活性多肽，廣泛分布于神經系統、呼吸系統、循環系統等，生物半衰期約為18 min[8]。近年來，有研究表明，人和鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞(typealⅡ veolarepithelial cell,AECⅡ)膜上也發現了CGRP特異性受體及結合位點,并在胚胎肺的發育和肺生理、病理過程均發揮了重要作用[9]。當不成熟肺受到氧化應激后CGRP通過免疫調節加快清除自由基，減少合成及釋放炎癥因子，并促進水通道蛋白過表達而減輕肺水腫，從而對機體起到抗炎、抗氧化損傷等作用。此外，在氧化應激的條件下AECⅡ增殖受到抑制，而CGRP可減弱該抑制作用，促進細胞轉化為AECⅡ，減少功能細胞凋亡并改善其存活，可能是CGRP促進高氧肺損傷修復的關鍵[10]。

Notch通路是一條進化上高度保守的信號通路[11]。Notch信號可介導轉錄因子的表達，由此實現調控肺泡上皮細胞和血管內皮細胞的生物學活動，如分化、增殖、凋亡等[12-13]。因此，Notch信號通路在肺的發育、損傷及修復過程中發揮著十分重要的作用。Notch信號包括Notch受體、配體、細胞內效應分子蛋白和調節分子等[14]。目前，在哺乳動物中發現的Notch受體有4種(Notch 1～4) ，均廣泛分布于肺組織中。氣道上皮細胞主要表達Notch 1、4,肺泡上皮、肺間質、血管內皮及成纖維細胞主要表達Notch 2、3。Notch 1與配體結合可啟動靶基因Hes、Su(H)轉錄，促進AECⅡ增殖。在氧化應激條件下血管內皮細胞、氣道和肺泡上皮細胞Notch 1活性下降，表達減少，AECⅡ轉化為AECⅠ，最終影響肺發育和肺損傷修復[15]。

本研究結果顯示，早產鼠在高氧暴露后肺組織結構破壞，炎性滲出，間質水腫，成纖維細胞增生，與此同時，Notch l及其下游靶基因Hes、heRP mRNA表達均下降。給予外源性CGRP干預后早產鼠肺組織病理損傷程度明顯減輕，Notch信號上升。當分別加入CGRP受體拮抗劑——CGRP8-37和Notch信號通路抑制劑——MW167時肺損傷程度加重，Notch信號下降。由此可見，CGRP可能通過促進Notch通路中Notch 1、Hes、heRP等生物信號的表達，從而對氧化應激性損傷的肺發揮保護效應。今后應從信號傳導通路方面闡釋CGRP如何實現Notch信號下游靶分子的調控，可能對高氧肺損傷的預防和治療產生深遠意義。