大鼠牙囊細胞成骨分化過程中Notch信號表達情況*

羅 文，鄺惠芳，王 婧

(1.海南醫學院第一附屬醫院口腔科，海口 570102；2.海南醫學院口腔醫學院，海口 571199)

來源于牙體組織的牙源性干細胞/祖細胞用于牙周疾病模型中具有良好的可行性和可預期性[1]。牙囊細胞(dental follicle cells,DFC)是牙周組織的前體細胞，其中包括牙槽骨成骨細胞、成牙骨質細胞和牙周成纖維細胞[2]。DFC成骨分化的不同階段和相關基因表達與眾多信號通路相關，如Notch、轉化生長因子-β(TGF-β)/骨形態發生蛋白(BMP)和WNT通路[3]。Notch通路通過Notch受體與膜結合型配體，如Jagged-1結合介導相鄰細胞間的信息交流。位于細胞表面的受體Notch和配體(如Jagged-1)結合后被γ分泌酶分解。胞內活化域(NICD)釋放并易位到細胞核中與RBP-JK結合，從而調控細胞增殖與分化[4]。本研究探討在大鼠DFC成骨分化時Notch信號的表達情況變化，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠購自海南醫學院藥物安評中心;α-MEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司;青霉素、鏈霉素、抗壞血酸、Ⅰ型膠原酶、Triton、牛血清清蛋白(BSA)、茜素紅、二脒基苯基吲哚(DAPI)均購自美國Sigma公司;小鼠抗大鼠波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體購自美國 Thermo公司，小鼠抗大鼠細胞角蛋白-14(CK-14)單克隆抗體購自英國Abcam公司;山羊抗小鼠異硫氰酸熒光素(FITC)-免疫球蛋白G(IgG)購自武漢博士德公司;Trizol試劑、引物Notch 1和β-actin均購自上海生工公司;M-MuLV逆轉錄酶試劑盒購自美國Fermentas公司;定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒SYBR Green Ⅰ kit購自瑞士羅氏公司;OLYMPUS IX71O倒置相差熒光顯微鏡與OLYMPUS CKX41倒置顯微鏡均購自日本HITACHI公司;LightCycler PCR 2.0系統購自瑞士羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠DFC原代培養

取出生后6～7 d的SD大鼠的乳鼠，無菌條件下將下頜骨切除放置于磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)中。體視顯微鏡下用顯微鑷分離下頜第一磨牙的牙胚，機械分離牙囊組織，放置于含1 %雙抗的α-MEM培養液中，用眼科剪徹底剪碎。37 ℃、放置在60 U/mL Ⅰ型膠原酶中消化60 min。加入4 mL細胞培養液(α-MEM+10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素+100 mg/mL抗壞血酸)，并將大鼠DFC轉移至T-25細胞培養瓶中，放置在37 ℃、5%二氧化碳培養箱中12 h讓細胞貼壁。細胞融合后用0.25%胰酶消化傳代。取第3代大鼠DFC作為實驗細胞。實驗過程中所有動物實驗操作符合海南醫學院倫理及操作要求。

1.2.2大鼠DFC來源的鑒定(Vimentin、CK-14細胞免疫熒光染色)

1.2.2.1細胞爬片的制作

取第3代對數生長期大鼠DFC消化制備成細胞懸液1×105/mL;,加入6孔細胞培養板中1×105個/孔，制作成爬片。

1.2.2.2細胞固定

待爬片上的細胞長至50%～60%，用4%多聚甲醛固定10 min。用1%Triton溶液配制的3%BSA封閉液中封閉作用30 min(37 ℃濕盒中)。

1.2.2.3孵育一抗

用1% BSA溶液按抗體說明書所示比例稀釋抗體，Vimentin(1∶250)、 CK-14(1∶100)，37 ℃濕盒中孵育2 h。

1.2.2.4孵育二抗

用1%BSA溶液按1∶200比例稀釋FITC結合的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃濕盒中孵育1 h。

1.2.2.5細胞核染色

每張爬片滴加200 μL的DAPI(1 μg/mL)溶液浸染2 min，雙蒸水洗2次，每次3 min。中性樹膠封片。

1.2.3成骨分化誘導

對照組繼續用基礎培養液培養，成骨誘導組加入地塞米松為基礎的成骨誘導液繼續培養21 d，3 d換1次誘導液，鏡下觀察出現不規則結節即可。棄成骨誘導液，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，茜素紅染色15 min對分化細胞進行染色，顯微鏡下采圖。

1.2.4qRT-PCR

使用Trizol試劑分別分離對照組和成骨誘導組總RNA，采用紫外分光光度計測定RNA的量和純度。使用M-MuLV逆轉錄酶試劑盒進行cDNA合成。qRT-PCR用SYBR Green Ⅰ kit和LightCycler PCR 2.0系統及LightCycler4.05軟件計算域值循環數。引物的設計和合成由上海生工公司完成，序列見表1。以β-actin為內參照，qRT-PCR檢測Notch1基因表達。反應結束后由軟件分析擴增曲線和產物溶解曲線，按相對定量法自動計算目的基因mRNA拷貝數。

表1 Notch 1與β-actin引物序列

1.3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數或率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠DFC的分離、鑒定及成骨分化潛能

大鼠DFC的原代培養3 d左右細胞從組織塊周圍爬出，見圖1A。DFC大部分呈紡錘狀、長梭形，少部分為多角形，其來源于外胚層間充質，具有典型的間充質成纖維細胞形態，見圖1B。CK-14染色為陰性，見圖1C。Vimentin幾乎表達于所有大鼠DFC，染色陽性，見圖1D。表明獲取的DFC是間充質干細胞，而無上皮細胞。混雜在大鼠DFC原代中的上皮細胞傳至第3代時大鼠DFC已基本被純化。用含有地塞米松的成骨誘導液誘導大鼠DFC 28 d后用茜素紅染色液染色可見許多紅色礦化小結節生成，見圖1E。

A：組織塊原代培養DFC；B：第3代DFC；C：CK-14抗體免疫熒光檢測；D：Vimentin抗體免疫熒光檢測；E：第3代DFC成骨誘導后茜素紅染色。圖1 大鼠DFC的分離、鑒定及成骨分化潛能

2.2 經成骨誘導后DFC的Notch 1 信號表達情況

與對照組比較，成骨誘導28 d后DFC的Notch 1基因表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

*：P<0.05，與對照組比較。圖2 經成骨誘導后DFC的Notch 1 信號表達情況

3 討 論

DFC作為骨組織工程的種子細胞之一，具有取材方便、多向分化能力強等優點，在骨修復研究中具有良好的應用前景[5]。牙囊是包繞于牙齒發育期成釉器和牙乳頭周圍的疏松結締組織，來源于外胚層間充質，在牙齒萌出和牙周組織形成中具有重要作用。DFC是成骨細胞和成牙骨質細胞的前體細胞，DFC中有堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、骨鈣蛋白、骨涎蛋白等成骨細胞標志物表達，有牙骨質附著蛋白等成牙骨質細胞標志物表達，經誘導分化可形成牙槽骨和牙骨質[6]。DFC與上皮根鞘細胞和牙髓細胞混合，可以誘導DFC成骨及成牙骨質方向分化，形成骨樣組織和成牙骨質組織[7]。本研究成功分離、培養、鑒定了DFC。DFC的鑒定包括細胞形態鑒定和細胞表面特異性標志物檢測。DFC大多為呈梭形的成纖維細胞樣,呈紡錘狀結構，漩渦狀排列，貼壁生長。DFC來源于外胚間充質，可檢測到間充質干細胞表面標志物——Vimentin染色陽性，同時上皮細胞表面標志物——CK-14染色陰性。利用茜素紅染色液對經成骨誘導的DFC進行染色可見若干紅色礦化小結節生成，表明DFC在合適的成骨誘導條件下可以向成骨分化，與相關研究結果一致[8]。

Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物，在進化上高度保守，通過相鄰細胞之間的相互作用調節細胞、組織、器官的分化和發育[9]。相鄰細胞可以通過Notch受體與配體的結合傳遞Notch信號。Notch信號是相鄰細胞之間通訊進而調控細胞發育分化的重要通路[10-11]。Notch 1作為Notch信號通路的主要受體，與其配體——Jagged 1及下游靶基因——Hes 1均為調控細胞分化的關鍵信號通路因子。在膠原誘導性關節炎(CIA)大鼠模型中，CIA組大鼠關節Notch 1呈強陽性表達，同時Jagged 1、Hes 1表達也顯著上升，高于對照組和中藥(傅山風濕外治方)控制組，差異均有統計學意義(P<0.05)，說明Notch 1/Jagged 1信號通路在誘發CIA的過程中得到激活，參與了CIA的發生、發展。通過藥物控制能顯著降低Notch 1、Jagged 1、Hes 1的表達，抑制CIA大鼠中Notch 1/Jagged 1信號通路的活化[12]。表明Notch 1與配體Jagged 1結合后能影響其下游靶基因Hes 1的轉錄，Notch 1的表達水平能影響Notch 1/Jagged 1信號通路的激活或抑制，從而調控多種炎癥因子的表達，如白細胞介素-6、γ干擾素等，發揮炎癥調控作用[13]。

Notch 1 是DFC維持未分化狀態的標記物之一，成骨分化過程中Notch信號在DFC中被激活[14]。Notch信號通路被激活不僅影響DFC成骨分化，而且影響BMP/DLX3信號通路(成骨分化相關通路)的激活，Notch信號通路可能通過負反饋回路調節DFC的成骨分化[15]。有研究發現，抑制Notch信號通路后可抑制骨肉瘤細胞MG63成骨分化，聯合調控Notch信號通路與分化抑制因子1靶基因的表達可遏制骨肉瘤異常成骨分化，誘導其向正常成骨分化，促使異常中斷的成骨分化重新發生[16]，說明Notch信號在骨肉瘤細胞MG63成骨分化中具有重要作用。有研究將人牙周膜干細胞經成骨誘導分化后發現，整合素金屬蛋白酶10(ADAM10)過表達組礦化結節形成量、成骨相關基因ALP、Runx2、OCN mRNA表達水平及Notch信號通路相關基因——Notch1、NICD、Hes mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，表明過表達ADAM10可促進人牙周膜干細胞增殖并抑制其成骨分化，其機制可能與Notch信號通路的激活有關[17]。在骨質疏松癥大鼠動物模型中，經成骨誘導后骨質疏松癥脂肪干細胞形成的礦化結節數量、Runx2、Notch1表達水平均比正常脂肪干細胞低，說明骨質疏松癥脂肪干細胞成骨能力比正常脂肪干細胞弱，且Notch信號通路受到抑制[18]。本研究結果顯示，與對照組比較，DFC經28 d成骨誘導后Notch 1基因表達下降，表明在成骨誘導環境下Notch信號通過下調影響DFC向成骨方向分化，與相關研究結果一致。然而Notch信號通路的各級信號因子如何相互作用精確調控DFC的成骨分化仍需進一步研究。

綜上所述，DFC表達間充質干細胞表面標志物和Notch信號，具有間充質干細胞的特性。在成骨分化過程中Notch信號表達量下調，通過負反饋回路調節DFC的成骨分化。