左金丸調(diào)控AMPK/mTOR通路介導(dǎo)的自噬途徑逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥機(jī)制研究*

劉 艷，孫 健

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科 201203)

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，早期發(fā)病隱匿，缺乏有效診斷指標(biāo)，大多數(shù)患者確診時(shí)往往已是中晚期，并出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移癥狀，具有高病死率且預(yù)后差等特點(diǎn)[1-2]。目前主要采取手術(shù)及放、化療等手段治療，其中5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)是進(jìn)展期胃癌常用的一線基礎(chǔ)化療藥物，但隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，患者易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，不利于化療的持久進(jìn)行[3]。因此，如何逆轉(zhuǎn)胃癌化療耐藥仍是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。自噬是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及死亡，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控機(jī)制[4]。張玉梅等[5]研究表明，抑制胃癌BGC823細(xì)胞自噬能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞化療敏感性。有研究表明，胃黏膜損傷是胃癌癌前病變的主要表現(xiàn)[6]。左金丸是中醫(yī)經(jīng)典名方，方中主藥黃連和吳茱萸的主要成分小檗堿、吳茱萸次堿等均能保護(hù)胃黏膜，對(duì)防治胃癌具有一定的作用[7]。既往研究表明，左金丸可抑制胃癌耐藥細(xì)胞SGC-7901/順鉑(DDP)的增殖，增加化療敏感性[8]。戚笑笑[9]研究表明，左金丸能顯著抑制饑餓狀態(tài)肺癌A549細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞增殖。目前，有關(guān)左金丸對(duì)胃癌耐藥影響的相關(guān)機(jī)制尚未明確，因此，本研究探討左金丸對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥及自噬的影響，以期為有效提高胃癌化療效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人胃癌細(xì)胞株SNU-1(bio-73415)購(gòu)自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司。5-FU注射液(0.25 g/10 mL)購(gòu)自山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；雷帕霉素(YT1833，25 mg)購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司；黃連藥材(190973)、吳茱萸藥材(200508)均購(gòu)自亳州市譽(yù)仁堂藥業(yè)有限公司；左金丸醇提物制備方法為分別取黃連、吳茱萸藥材1 800、300 g，加8倍量75%乙醇，回流提取2次(每次1 h)，合并提取液并回收乙醇，減壓干燥，得左金丸醇提物干粉558 g，回收率為26.57%。5-3-2(4,5-二甲基噻唑-2)-2-四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，1120-02-1)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(CA1020)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2，BYFG-70R-36053)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax，ATA25290)、RM-9106微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅰ，LC3-Ⅰ)抗體(H00008650-A01)、LC3-Ⅱ(FNab04717)、家蠶隔離體蛋白1(sequestosome-1，p62)抗體(H00008650-A01)、AMP激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)抗體(ab51520)、p-AMPK抗體(ATA32549)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR，ATA33361)、p-mTOR(IC194464)、山羊抗兔HRP(F030222)二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。熒光倒置顯微鏡(型號(hào)CKX41-A32FL/PH)購(gòu)自上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；流式細(xì)胞儀(型號(hào)CytoFLEX)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司；Tecnai 20 U-Twin型透射電鏡購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)ELx800)購(gòu)自上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

人SNU-1細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的RPMI -1640培養(yǎng)基、37 ℃飽和濕度、5%二氧化碳及95%氧氣培養(yǎng)箱中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每2～3 天換液，利用5-FU濃度梯度法建立5-FU耐藥細(xì)胞株，以4.0 μg/mL 5-FU維持細(xì)胞耐藥性。SNU-1、SNU-1/5-FU細(xì)胞均采用5-FU培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞分組及處理

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNU-1、SNU-1/5-FU細(xì)胞，均在培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50 μg/mL的5-FU溶液，培養(yǎng)48 h。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞耐藥性，將細(xì)胞接種于24孔板(2.5×105個(gè)/孔)進(jìn)行培養(yǎng)，分別培養(yǎng)48 h后向各孔加入MTT(5 g/L)20 μL，4 h后棄上清液，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩、溶解。在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔細(xì)胞吸光度(A)值，重復(fù)3次，取平均值，繪制生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞存活率(%)=(藥物處理組A值/藥物未處理組A值)×100%。采用線性回歸法計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concentration，IC50)。采用SNU-1細(xì)胞IC50時(shí)的5-FU質(zhì)量濃度(19.05 μg/mL)溶液處理SNU-1(SNU-1組)、SNU-1/5-FU(SNU-1/5-FU組)細(xì)胞，處理后的SNU-1/5-FU細(xì)胞分為左金丸組(加入含100 μg/mL左金丸溶液[8]培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h)和左金丸聯(lián)合自噬激活劑組(加入含100 μg/mL左金丸溶液及250 nmol/L自噬激活劑——雷帕霉素[10]培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h)。收集細(xì)胞供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SNU-1/5-FU細(xì)胞凋亡率

取1.2.2項(xiàng)培養(yǎng)48 h的各組SNU-1、SNU-1/5-FU細(xì)胞接種于24孔板(2.5×105個(gè)/孔)，參照Annexin-V FITC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)，以5 μL PI、5 μL AnnexinV-FITC雙染試劑4 ℃避光染色30 min，稀釋；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SNU-1/5-FU細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.4透射電鏡下觀察自噬體

收集1.2.2項(xiàng)培養(yǎng)48 h的各組SNU-1、SNU-1/5-FU細(xì)胞分別接種于24孔板(2.5×105個(gè)/孔)，胰酶消化(0.25%)，細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)刮取細(xì)胞，離心10 min，細(xì)胞沉淀采用磷酸鹽緩沖溶液清洗，2.5%戊二酸醛固定，4 ℃冰箱保存過(guò)夜，50%乙醇常規(guī)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，60 ℃聚合48 h，切片(厚度80 nm)，枸櫞酸鉛染色，置于透射電鏡下觀察自噬體，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測(cè)，計(jì)算自噬體自噬泡/細(xì)胞質(zhì)總面積。

1.2.5免疫印跡法檢測(cè)凋亡、自噬相關(guān)蛋白及AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

收集1.2.2項(xiàng)培養(yǎng)48 h的各組SNU-1、SNU-1/5-FU細(xì)胞以RIPA裂解并提取總蛋白，檢測(cè)濃度及純度，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳法進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，放入脫脂奶粉(5%)溶液室溫封閉2 h，分別加入一抗凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax)、自噬相關(guān)蛋白(LC-3、p62)、AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白(AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR)和內(nèi)參β-actin，均為1∶500的稀釋比，4 ℃過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，顯影、定影，分析各蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 SNU-1/5-FU細(xì)胞耐藥性

隨5-FU質(zhì)量濃度的增加，SNU-1、SNU-1/5-FU細(xì)胞增殖率下降，SNU-1的半數(shù)抑制濃度(IC50)為19.05 μg/mL，SNU-1/5-FU的IC50為45.07 μg/mL，耐藥指數(shù)為2.36。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 SNU-1、SNU-1/5-FU細(xì)胞在5-FU作用下的細(xì)胞存活率

表1 SNU-1、SNU-1/5-FU細(xì)胞在5-FU作用下的細(xì)胞存活率

2.2 SNU-1/5-FU細(xì)胞凋亡情況

SNU-1組、SNU-1/5-FU組、左金丸組、左金丸聯(lián)合自噬激活劑組細(xì)胞凋亡率分別為(31.63±3.59)%、(7.58±1.59)%、(21.16±4.31)%、(15.92±3.45)%。與SNU-1組比較，SNU-1/5-FU組細(xì)胞凋亡率明顯降低，與SNU-1/5-FU組比較，左金丸組、左金丸聯(lián)合自噬激活劑組細(xì)胞凋亡率均明顯升高，與左金丸組比較，左金丸聯(lián)合自噬激活劑組細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞凋亡情況比較

2.3 SNU-1/5-FU細(xì)胞自噬情況

SNU-1組、SNU-1/5-FU組、左金丸組、左金丸聯(lián)合自噬激活劑組自噬泡/細(xì)胞質(zhì)總面積分別為(2.83±0.40)%、(8.69±1.30)%、(3.98±0.56)%、(5.03±0.76)%。與SNU-1組比較，SNU-1/5-FU組自噬體數(shù)量、自噬泡/細(xì)胞質(zhì)總面積均明顯增加；與SNU-1/5-FU組比較，左金丸組、左金丸聯(lián)合自噬激活劑組自噬體數(shù)量、自噬泡/細(xì)胞質(zhì)總面積均明顯減少；與左金丸組比較，左金丸聯(lián)合自噬激活劑組自噬體數(shù)量、自噬泡/細(xì)胞質(zhì)總面積均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞自噬情況比較(×200)

2.4 SNU-1/5-FU細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

與SNU-1組比較，SNU-1/5-FU組細(xì)胞Bax蛋白、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高，Bcl-2、p62蛋白表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SNU-1/5-FU組比較，左金丸組、左金丸聯(lián)合自噬激活劑組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯降低，Bcl-2、p62蛋白表達(dá)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與左金丸組比較，左金丸聯(lián)合自噬激活劑組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高，Bcl-2、p62蛋白表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表2。

圖4 各組細(xì)胞增殖、凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較

表2 各組細(xì)胞增殖、凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.5 SNU-1/5-FU細(xì)胞AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)

與SNU-1組比較，SNU-1/5-FU組SNU-1/5-FU細(xì)胞p-AMPK/AMPK表達(dá)明顯升高，p-mTOR/mTOR表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SNU-1/5-FU組比較，左金丸組、左金丸聯(lián)合自噬激活劑組p-AMPK/AMPK表達(dá)明顯降低，p-mTOR/mTOR表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與左金丸組比較，左金丸聯(lián)合自噬激活劑組p-AMPK/AMPK表達(dá)明顯升高(P<0.05)，p-mTOR/mTOR表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5、表3。

表3 各組AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討 論

胃癌是胃黏膜上皮細(xì)胞惡性腫瘤，發(fā)病早期癥狀不典型，大多數(shù)患者于中晚期才得以確診，以致2年生存率僅為10.00%。目前，化療是治療晚期胃癌的優(yōu)選手段，化療藥物主要通過(guò)抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用[11]。胃癌常用一線化療藥物主要以5-FU為主，但由于個(gè)體差異及胃癌細(xì)胞獲得性及內(nèi)在耐藥性，使5-FU治療胃癌的總生存率仍較低[12]。因此，逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對(duì)5-FU耐藥性具有較大意義。

左金丸源于《丹溪心法》，由黃連、吳茱萸兩味中藥材組成，具有清肝瀉火、降逆止嘔等功效，現(xiàn)代藥理研究表明，此方能防治胃癌的發(fā)生[13]。湯慶豐[14]研究表明，左金丸能促進(jìn)線粒體轉(zhuǎn)位誘導(dǎo)胃癌DDP耐藥株SGC7901/DDP凋亡，增加細(xì)胞化療敏感性。本研究結(jié)果顯示，SNU-1/5-FU細(xì)胞IC50明顯高于其親本株SNU-1細(xì)胞，且左金丸聯(lián)合5-FU對(duì)SNU-1/5-FU細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，與湯慶豐[14]研究結(jié)果一致，說(shuō)明左金丸可能增加胃癌SNU-1/5-FU細(xì)胞對(duì)5-FU的化療敏感性，但相關(guān)機(jī)制尚有待于深入闡述。

自噬對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞生存具有重要作用，有研究表明，其有助于腫瘤細(xì)胞適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、低氧及放化療刺激等惡劣微環(huán)境，增加細(xì)胞化療耐藥性[15-17]。自噬激活時(shí)LC3-Ⅰ與自噬泡表面磷脂乙酰醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ含量多少與自噬泡數(shù)量呈正比，可以判斷細(xì)胞自噬活性的強(qiáng)弱；p62是自噬底物并可被LC3-Ⅱ降解，用于評(píng)定自噬活性[18-19]。李冬冬等[20]研究表明，抑制NAC-1基因表達(dá)可有效抑制卵巢癌DDP耐藥株(SKOV3/DDP)的自噬水平，增加細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性。龔永昌等[21]研究表明，姜黃素可通過(guò)抑制胃癌AGS細(xì)胞自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與SNU-1組比較，SNU-1/5-FU組細(xì)胞自噬體數(shù)量、自噬泡/細(xì)胞質(zhì)總面積、Bax、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高，Bcl-2、p62表達(dá)均明顯降低。說(shuō)明SNU-1/5-FU細(xì)胞對(duì)5-FU產(chǎn)生耐藥性可能與自噬活性增加有關(guān)；而左金丸可明顯抑制SNU-1/5-FU細(xì)胞自噬，且與左金丸組比較，左金丸聯(lián)合自噬激活劑組細(xì)胞凋亡率明顯增加、自噬又一定程度被激活，更加說(shuō)明左金丸可能通過(guò)抑制SNU-1/5-FU細(xì)胞自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)SNU-1/5-FU細(xì)胞化療敏感性。

AMPK/mTOR通路是一條重要的自噬調(diào)節(jié)途徑，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)AMPK被激活并發(fā)生磷酸化反應(yīng)，可抑制下游mTOR基因磷酸化反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)自噬級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生[22]。有研究表明，抑制TRIM14表達(dá)可明顯抑制胃癌5-FU耐藥細(xì)胞株SGC7901/5-FU細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能是通過(guò)抑制AMPK/mTOR通路活化抑制細(xì)胞自噬實(shí)現(xiàn)的[23]。本研究結(jié)果顯示，與SNU-1組比較，SNU-1/5-FU組細(xì)胞p-AMPK/AMPK表達(dá)明顯升高，p-mTOR/mTOR表達(dá)明顯降低；而左金丸可明顯降低AMPK/p-AMPK表達(dá)，明顯升高p-mTOR/mTOR表達(dá)，說(shuō)明左金丸可能抑制AMPK/mTOR通路活化，增加SNU-1/5-FU細(xì)胞化療敏感性，然而加入自噬激活劑后SNU-1/5-FU細(xì)胞AMPK/mTOR通路又一定程度被激活。說(shuō)明左金丸可能通過(guò)抑制AMPK/mTOR通路活化抑制SNU-1/5-FU細(xì)胞自噬，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞化療敏感性。

綜上所述，左金丸可能通過(guò)抑制AMPK/mTOR通路介導(dǎo)的自噬，誘導(dǎo)SNU-1/5-FU細(xì)胞凋亡，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性。然而本研究并未對(duì)SNU-1/5-FU細(xì)胞自噬水平及其與AMPK/mTOR通路的具體作用機(jī)制進(jìn)行探討，后期應(yīng)深入闡述。