金屬有機框架作為模擬酶在生化分析中的應用進展

關樺楠，張 悅，王丹丹，吳永存，彭 勃

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150028）

天然酶作為一種生物大分子催化劑，在溫和條件下，可以高效催化各種生物化學反應，具有高特異性、底物專一性和種類多樣性等優點，在生化分析中起著重要的作用，廣泛應用于化學化工、農業[1]、生物醫學[2]、環境分析和食品工程[3]等眾多領域。然而，天然酶在極端條件下穩定性差、易變性失活，對環境變化高度敏感、易影響催化效率，而且天然酶的生產制備和純化回收的成本高、難度大[4]，這極大限制了天然酶的應用。因此，發展人工合成具有類酶活性的材料來代替天然酶引起了廣泛關注，金屬氧化物[5]、碳基納米結構[6]、貴金屬基納米結構[7]、過渡金屬化合物[8]和金屬有機框架[9]（Metal Organic Frames，MOFs）等已經被發現具有類酶活性。其中，由金屬離子與有機配體結合而成的金屬有機框架被認為是模擬酶的理想材料，已成為當前研究的熱點。與天然酶相比，MOFs具有成本低、結構穩定、易于貯存、易于回收和活性可調等明顯優勢[10]，而且其物理化學性質獨特[11]，功能多樣，被廣泛應用于生化分析。本文綜述金屬有機框架作為模擬酶，在葡萄糖、活性蛋白、脂類活性成分、維生素、無機鹽、致病菌、重金屬的檢測和其他活性物質等的生化分析中的應用進展，并展望該領域的發展趨勢。

1 金屬有機框架概述

金屬有機框架是由金屬離子或金屬簇與有機配體通過配位鍵自組裝而成的多孔網狀結構的雜化材料，具有比表面積大、孔徑可調、結構多樣和表面修飾等特點[12-13]。構成這類材料的常見金屬有Zn、Cr、Co、Ni、Cu、Ag、Al和堿金屬等，與金屬配位的配體通常是羧類、唑類、磷酸酯類等有機分子。不同的金屬框架作為模擬酶的活性不同，如具有過氧化氫酶、過氧化物酶活性、氧化物酶活性等。目前，已有多種成熟的方法合成形貌各異的金屬有機框架，如拉瓦錫材料研究所（Material Institute of Lavoisier，MI L）的金屬有機框架MIL-53、MIL-88和MIL-101[14-16]；沸石咪唑酯骨架類（Zeolite Imidazole Ester Framework，ZIF）的金屬有機框架ZIF-8、ZIF-9和ZIF-67等[17-19]；香港科技大學研制的一種經典三維多籠多孔網絡結構的金屬有機框架HKUST-1[20]；單金屬系列的金屬有機框架Cu-MOFs、Co-MOFs、Fe-MOFs和Ce-MOFs等[21-24]；此外，還有其他復合金屬有機框架[25]等。

2 金屬有機框架模擬酶在生化分析中的應用

2.1 在葡萄糖分析中的應用

葡萄糖是生物重要的能量來源。諸多研究結果表明[26-27]，金屬有機框架可將葡萄糖經葡萄糖氧化酶產生的過氧化氫催化為具有氧化活性的自由基，而該自由基可將無色的3,3‘,5,5‘-四甲基聯苯胺（TMB）底物氧化為藍色的oxTMB。因此，基于這一原理并采用比色法，可對葡萄進行定性定量分析。目前，檢測葡萄糖常用的方法有色譜法、熒光法和滴定法等，與這些方法相比，利用金屬有機框架作為模擬酶對葡萄糖進行檢測具有成本低、簡單高效和靈敏準確的優勢。

CHEN等[28]提出了一種簡便的制備鉑納米粒子（PtNPs）修飾二維金屬有機骨架納米復合材料的方法，將一種類血紅素結構的配體TCPP（Fe）與金屬銅配合形成金屬有機框架納米薄片（Cu-TCPP（Fe）），進而用光化學還原法將其與PtNPs結合，形成一種雜化納米材料PtNPs/Cu-TCPP（Fe）。經研究表明，PtNPs/Cu-TCPP（Fe）比PtNPs、Cu-TCPP（Fe）納米薄片以及兩者混合物表現出優異的過氧化物模擬酶活性。研究還將PtNPs/Cu-TCPP（Fe）與葡萄糖氧化酶結合，建立了葡萄糖級聯反應比色法，檢測機理如圖1所示。該分析方法葡萄糖檢出限為0.994 μmol/L，線性范圍為2～200 μmol/L，具有良好的靈敏度和選擇性。與天然過氧化物酶相比，PtNPs/Cu-TCPP（Fe）雜化納米薄片制備簡單、成本低、穩定性好，為利用金屬有機框架作為模板制備新型功能雜化納米材料用于葡萄糖的檢測分析，提供了新的視角。

圖1 PtNPs/Cu-TCPP（Fe）雜化米片的合成方法及其對過氧化氫和葡萄糖比色檢測的機理示意圖Fig.1 Schematic illustration of the synthesis method of PtNPs/Cu-TCPP（Fe） hybrid nanosheets and their application in colorimetric detection of hydrogen peroxide and glucose

無花果蛋白酶[29]（Ficin）是一種硫醇蛋白酶，具有較強的過氧化物酶活性。ZHENG等[30]利用Ficin的低成本、溫度耐受性和pH耐久性等優點，制備了一種多孔金屬有機框架PCN-333（Fe），并將Ficin封裝在其中，形成Ficin@PCN-333（Fe）復合物。研究發現， Ficin@PCN-333（Fe）具有較好的催化性能，可用于提高葡萄糖含量檢測的靈敏度和選擇性。在本研究建立的Ficin@PCN-333（Fe）與葡萄糖結合比色法，葡萄糖的檢出限為97 nmol/L，線性范圍為0.5～180 μmol/L。

2.2 在活性蛋白分析中的應用

在腫瘤和癌癥早期，一些蛋白生物標志物的濃度會迅速升高，因此，檢測這些蛋白生物標志物對治療癌癥和腫瘤具有重要意義。傳統的檢測方法，例如免疫組織化學，酶聯免疫吸附實驗和放射免疫分析，具有靈敏度低、操作繁瑣、耗時長、有害影響等缺點。但是，功能化金屬有機框架模擬酶蛋白生物標志物檢測體系，具有靈敏、高效和準確等特點，在醫藥領域具有重要的實踐意義。

黏蛋白1（Mucin 1，MUC1）是一種具有高分子量的I型透射蛋白，主要存在于組織和器官的管腔或腺腔表面附近的上皮細胞中，其在異常表達下主要表現為含量增加、細胞表面分布改變和結構改變，可以作為腫瘤早期診斷的潛在靶分子[31]。WANG等[32]合成了具有較強過氧化物酶活性的N-（4-氨基丁基）-N-（乙基異質醇）功能化鐵基金屬-有機骨架（ABEI/MIL-101（Fe）），并將其作為高效電化學發光（Electronics Components Laboratory，ECL）指示劑構建敏感性免疫傳感器，機理如圖2所示。ABEI/MIL-101（Fe）作為過氧化物酶模擬物可加速過氧化氫分解，產生大量的活性羥基，增加該免疫傳感器的ECL檢測信號，提高靈敏性。其用于MUC1的檢測，檢出限為1.6 fg/mL，線性范圍為10 fg/mL～10 ng/mL。該免疫傳感器可對生物標記進行敏感檢測，用于腫瘤治療的早期診斷，拓寬了金屬有機框架在醫學領域的應用。

圖2 合成及反應機理示意圖Fig.2 Schematic diagram of synthesis and reaction mechanism

甲胎蛋白（Alpha-Fetoprotein，AFP）是一種用于早期診斷癌癥的敏感生物標志物[33]，但在血液中的含量極低，不易被準確的檢測。ZHANG等[34]將氯化高鐵血紅素（Hemin）和金納米粒子（Au）進行結合，形成Hemin-Au核，并將其封裝于鋱基金屬有機框架中，得到一種具有環境穩定性較高、過氧化物酶活性較強、具有金納米粒子雙重催化性的金屬有機框架復合材料模擬酶（Hemin-Au@MOF）。利用Hemin-Au@MOF對夾式甲胎蛋白進行測定，檢出限為0.02 ng/mL，線性范圍為0.08～43.00 ng/mL。該檢測方法檢出限低、靈敏性高，為癌癥生物標志物甲胎蛋白的檢查提供了新方法。

2.3 在脂類活性成分分析中的應用

膽固醇是動物細胞膜的重要組成成分，是維持細胞正常結構和功能所必需的物質。它還在幾種維生素、類固醇激素和膽汁酸的合成中發揮重要作用。然而，當人體中膽固醇含量過高時，會引發多種心血管疾病。因此，在醫學和臨床診斷中，膽固醇是不可缺少的重要檢測指標[35]。膽固醇的臨床檢測，通常利用以辣根過氧化物酶為基礎的比色法進行測定。然而，辣根過氧化物酶為蛋白質，在加熱或化學變化過程中容易變性，制備成本高、耗時長、貯存困難。利用金屬有機框架模擬辣根過氧化物酶對膽固醇進行檢測，可以提高檢測靈敏性和準確性，降低檢測成本。

WU等[35]制備了具有較強的過氧化物酶活性的金屬有機框架（Fe3O4@MIL-100（Fe）），并以此建立了一種簡單、靈敏和高效的膽固醇比色檢測法，用于血清中膽固醇的檢測，作用機理如圖3所示。該檢測方法的檢出限為0.8 μmol/L，線性范圍為2～50 μmol/L，而且可以磁性回收，降低成本。

圖3 膽固醇氧化酶（ChOx）和Fe3O4@MIL-100（Fe）比色法檢測膽固醇的機理示意圖Fig.3 Schematic illustration of colorimetric detection of cholesterol using cholesterol oxidase （ChOx） and Fe3O4@MIL-100（Fe） catalyzed reactions

JAVAD等[36]制備了一種具有多孔結構新型金屬有機框架模擬酶，可將膽固醇氧化酶封裝進去，形成天然酶和模擬酶相結合的復合式膽固醇氧化納米酶（ChOx-MOF）。與純粹的天然膽固醇氧化酶相比，ChOx-MOF氧化能力更強，環境適應能力更好。利用ChOx-MOF和制備的過氧化物酶模擬物（AgNC/MoS2-NS）結合熒光檢測法對膽固醇進行檢測，檢出限為0.03 mol/L，線性范圍為0.06～15 mol/L。該方法具有良好的選擇性和靈敏度，可用于食品中膽固醇的測定，也可應用于人體血液中膽固醇的檢測。

2.4 在維生素分析中的應用

維生素作為一種微量成分，在人體生長和新陳代謝諸多生化反應中發揮著重要作用。維生素人體所需含量低，但當其含量異常時會引發多種疾病。因此，建立一種快速、準確的維生素檢測方法在實際應用中具有重要意義。金屬有機框架作為模擬酶應用于維生素的檢測具有高效、靈敏等優勢，在維生素檢測方面具有廣闊的應用前景。

抗壞血酸又稱維生素C，是一種水溶性維生素，廣泛存在于水果蔬菜中。ZHENG等[37]制備了一種具有過氧化物模擬酶活性的金屬有機框架MOF-808，可以在較寬泛的pH范圍內具有高效的催化活性，并以此建立了一種簡便、靈敏的抗壞血酸比色檢測方法。以TMB作為顯色底物，在過氧化氫的存在下MOF-808可以將其轉化為藍色物質，而添加抗壞血酸可抑制這一現象，以此可以對抗壞血酸進行檢測，機理如圖4所示。實驗結果表明，抗壞血酸的最低檢出限為15 μmol/L，線性范圍為30～1030 μmol/L。該方法不僅具有簡便、靈敏和快速等優點，而且還證明了MOF-808是一種特殊的模擬酶材料，可以在中性條件下進行檢測，為金屬有機框架模擬酶在中性溶液條件下發揮高催化活性提供理論基礎。目前研究普遍認為，MOF-808過氧化物酶模擬酶是用于抗壞血酸檢測最好的比色生物傳感器之一[37]。

圖4 MOF-808比色法檢測抗壞血酸機理示意圖Fig.4 Schematic illustration of the detection mechanism ofascorbic acid by MOF-808 colorimetric method

硫胺素（Thiamine）又稱維生素B1，是一種存在于多種食物中的天然營養素，是維持神經和心血管系統正常功能的重要生長因子[38]。硫胺素易在堿性溶液中被氧化為具有強熒光性的硫代鉻[39]，因此，硫胺素常用作熒光底物，用于過氧化物檢測。TAN等[39]利用硫胺素作為過氧化物酶底物，證明銅基金屬有機框架（HKUST-1）具有過氧化物類酶活性，可以高效的催化過氧化氫氧化硫胺素，并以此為基礎，建立了一種簡便的硫胺素熒光檢測方法。在過氧化氫存在下，HKUST-1能有效催化非熒光硫胺素向強熒光硫代色素的轉化，結合熒光檢測方法，可有效地檢測硫胺素含量。該方法線性范圍為4～700 μmol/L，檢出限為1.0 μmol/L。KHAN等[40]基于辣根過氧化物酶（HRP）在過氧化氫存在下的催化活性，并采用熒光分光光度法，建立了一種新型的硫胺素檢測方法，檢出限為0.015 mg/mL。

2.5 在無機鹽分析中的應用

磷酸鹽及其酶解在諸多生化反應的過程中以及某些重大疾病的發生過程中起著關鍵性的作用。磷酸鹽具有多種形式，一方面，在細胞信號傳遞、能量代謝等多種生物過程中發揮著重要作用，另一方面，過量的磷酸鹽可以使水體污染，給水生生物帶來危害。因此，明確磷酸鹽的含量以及在相關生理和病理事件中的作用，具有重要意義。利用基于金屬有機框架制備的模擬酶，對磷酸鹽進行測定和跟蹤，具有高效、準確等優勢，可推廣其在生物化學分析中的應用。

QIN等[41]利用各種磷酸鹽（一磷酸腺ADP、二磷酸腺AMP、三磷酸腺苷ATP、焦磷酸鹽PPi和磷酸鹽Pi等）調節過氧化物酶模擬物的活性，制作了2D M-TCPP（Fe）納米酶（M=Zn,Co,Cu）的傳感器陣列。此傳感器可以探測由三磷酸腺苷雙磷酸酶和焦磷酸酶催化的ATP和PPi水解過程，并成功建立了生物樣品中磷酸鹽檢測的傳感器。相較于每次只能檢測一個既定的磷酸鹽的單個傳感器，該納米傳感器陣列可以同時辨別多個磷酸鹽，為納米傳感器應用于磷酸鹽的鑒別及其酶水解的探索開創了新的思路。

當水中的磷酸鹽過量時，會導致藻類生物過度生長，從而降低水中的含氧量，進而對其他生物造成威脅[42]。WANG等[42]研究合成了3種銅基金屬有機框架，并研究證明其具有過氧化物模擬酶活性，可將TMB催化形成藍色物質。但在磷酸鹽的存在下，可以抑制該顯色反應。基于這一現象，該研究團隊構建了測定磷酸鹽的比色法，機理如圖5所示。磷酸鹽的檢出限為20 nmol/L，線性范圍為0.05～5 μmol/L。該項研究為金屬有機框架應用于環境監測領域提供了可能。

圖5 Cu-MOF比色法檢測磷酸鹽機理示意圖Fig.5 Schematic illustration of the detection mechanism of phosphate by Cu-MOF colorimetric method

2.6 在致病菌分析中的應用

致病菌給人類的健康帶來了巨大的威脅，因此對致病菌進行敏感、選擇性的檢測具有重要意義。相比于采用傳統培養檢測的耗時長和聚合酶鏈式反應法的成本高等缺點，以金屬有機框架作為模擬酶對致病菌進行檢測，具有快速、簡單、經濟和準確等優點，可以成為一種新型檢測病原菌的工具。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種存在于兩棲動物、爬行動物和養殖魚類中的新興致病菌，其可以引起人類的多種感染以及在短時間內造成魚類的高死亡率[43]。XU等[44]利用水熱法制備了具有規則金剛石晶體形態的復合金屬有機框架納米材料（Co3Fe-MMOF），其表現出了顯著的過氧化物酶活性。利用聚多巴胺將抗體固定在其表面后，將可以發生顯色反應的具有特異抗體識別的Co3Fe-MMOF與磁分離相結合，建立一種新型的高選擇性和靈敏性的嗜水氣單胞菌比色檢測法，其檢出限為17 CFU/mL，線性范圍為62～6.2×108CFU/mL。該方法為嗜水氣單胞菌的檢測提供了一種新型酶聯免疫吸附檢測法且可以拓展應用于其他致病菌領域內的檢測，也為其他致病菌的檢測提供了新思路。

金黃色葡萄球菌是一種常見的致病菌，在自然界分布范圍極廣。WANG等[45]利用2-氨基對苯二甲酸和硝酸銅作為原料，采用水熱法合成銅基金屬有機框架納米粒子（Cu-MOF）。由于其表面存在豐富的胺基，使得金黃色葡萄球菌適配體易于修飾Cu-MOF納米粒子，確保了其能夠選擇性地識別金黃色葡萄球菌。將Cu-MOF作為過氧化物酶模擬物的催化顯色反應與適配體識別和磁分離相結合，建立了一種金黃色葡萄球菌比色檢測方法。機理如圖6所示，金黃色葡萄球菌檢測的檢出限為20 CFU/mL，線性范圍為50～10000 CFU/mL。該方法具有簡便、靈敏、高選擇性等優點，可用于生物醫藥和食品工程等行業中金黃色葡萄球菌的檢測。

圖6 比色法檢測目標細菌的示意圖Fig.6 Schematic illustration of colorimetric detection of target bacteria

2.7 在重金屬分析中的應用

重金屬是指比重大于5的金屬[46]，是一種對生物和環境具有嚴重影響的污染物。重金屬通過食物鏈的富集放大作用最終會進入人體，對人體產生極大的危害，如神經系統受到損傷和致癌等。目前，檢測分析重金屬的方法都需要大型的儀器設備，具有檢測成本較高和操作復雜等缺點，而利用金屬有機框架進行檢測則具有簡便、經濟和靈敏等優點，可用于快速檢測重金屬。

XU等[47]采用一步自組裝法將酸性ACP和Hemin裝入多功能鋅基有機框架合成多功能傳感元件（ACP/Hemin@Zn-MOF），并以此制備一種高性能傳感器，該傳感器具有熒光特性、過氧化物酶活性和砷識別特異性。可以實現對有毒無機砷的高靈敏度和高選擇性的檢測，檢出限為1.05 μg/L，線性范圍為3.33～300 μg/L，成功應用于水稻中無機砷含量的檢測。

LI等[48]構建了一種無貴金屬有機框架（ZIF-8/GO）作為探針，在銀離子的存在下，可觸發其較強的過氧化物酶活性，將顯色底物TMB轉化為肉眼可見的藍色，機理如圖7所示。基于此可用于水和血清樣品中高選擇性和高靈敏度的銀離子比色檢測，檢出限為1.43 nmol/L，線性范圍為2～5 nmol/L。ZIF-8/GO探針具有成本低、操作方便、靈敏度和選擇性好等優點，使其成為工業上經濟友好的檢測銀離子的一種方法，彌補了貴金屬納米酶高成本的缺點，擴大了金屬有機框架在工業上的應用。

圖7 ZIF-8/GO合成及其比色檢測銀離子的機理示意圖Fig.7 Schematic diagram of the synthesis of ZIF-8/GO and its colorimetric detection of silver ions

2.8 在其它生化活性成分分析中的應用

多巴胺（Dopamine）作為一種神經遞質，若在人體內積累過多，可極大消耗體內的能量，由此，可引起神經功能障礙甚至可以導致嬰幼兒早夭。另一方面，多巴胺的缺乏可以使人體失去注意力以及對肌肉的控制。因此，多巴胺的定量檢測在抑郁癥、精神分裂癥、帕金森病等神經系統疾病的臨床診斷中至關重要[49]。

WANG等[50]利用水熱法合成了一種含銅的金屬有機框架作為模擬酶（Cu（PDA）（DMF）），其由1,10-菲羅啉-2,9-二羧酸（H2PDA）和Cu2+離子構成，表現出較高的過氧化物酶催化活性，并可以催化無色底物TMB與過氧化氫反應生成藍色產物。然而，在多巴胺存在的情況下，Cu（PDA）（DMF）的過氧化物酶活性可被明顯抑制，機理如圖8所示。基于這一現象，建立了一種具有良好選擇性和高靈敏度的多巴胺比色檢測法，線性范圍為10～100 μmol/L。該研究成果將Cu（PDA）（DMF）用于檢測人類尿液和藥物樣品中的多巴胺，并表現出良好的穩定性和強勁的催化活性。因此，可以研發新型金屬有機框架作為模擬酶對其他糖類或物質進行高效快速檢測，擴大金屬有機框架作為模擬酶在生化分析中的應用。c.金屬框架模擬酶與其他檢測法進行聯用。金屬框架作為模擬酶在生化分析中應用時，常使用比色法，有時會造成數據不準確，檢測不靈敏等現象。而電化學檢測方法可以靈敏的檢測生化反應中電子的移動，并以電信號輸出，可以很好地分析體系中的反應原理和待測物的含量。因此，可以拓展金屬有機框架模擬酶與電化學檢測法進行聯用，建立更加靈敏、準確和快速的檢測方法。綜上所述，金屬有機框架作為模擬酶在生化分析中具有較大的研究空間和廣闊的應用價值，將為生化檢測提供一種新方法。

圖8 [Cu（PDA）（DMF）]過氧化物酶比色檢測DA的機理示意圖Fig.8 Schematic illustration of peroxidase-like activity of[Cu（PDA）（DMF）] and its application for colorimetric DA detection

次黃嘌呤（Hypoxanthine）是一種重要的生物堿，其主要由三磷酸腺苷在酶的降解作用下產生，可用于評估水產品早期的新鮮度[51]。HU等[52]采用自下而上的方法，制備了氨基功能化的二維金屬有機框架納米薄片（NH2-Cu-MOF），研究表明，該納米薄片既有較強的過氧化物酶活性又有優良的熒光性能。基于此，建立了一種檢測次黃嘌呤的生物傳感器，次黃嘌呤的檢出限為3.93 μmol/L，線性范圍為10～2000 μmol/L。該生物傳感器已應用于魚體中次黃嘌呤的檢測，并取得了滿意的成果，為食品安全分析提供了有力的檢測方法。

3 結論

該文總結了近年來金屬有機框架作為模擬酶在生物化學分析中的研究進展。利用金屬有機框架作為模擬酶對生化物質進行檢測具有簡便、靈敏、準確和穩定等優點，彌補了天然酶固有的缺陷。盡管如此，金屬有機框架作為模擬酶的應用和發展仍面臨諸多挑戰：a.金屬有機框架作為模擬酶的種類需要增加。目前，金屬有機框架大多作為過氧化物模擬酶和氧化模擬酶在生化分析中進行應用，而有些納米酶已被研究出可作為超氧化物歧化模擬酶或過氧化氫模擬酶進行應用，因此，金屬有機框架可進一步被研究出具有其他模擬酶活性。b.在生化分析中，金屬有機框架模擬酶的應用具有局限性，需擴大其應用范圍。例如，在糖類的檢測中，金屬有機框架大多作為過氧化物模擬酶對葡萄糖進行檢測，很少檢測其他糖類。