基于網絡藥理學和分子對接探究黃芪-女貞子治療免疫缺陷病的作用機制

趙志恒，畢經會，葉詩潔，黃永康，閔 婷，王宏勛,3，王麗梅,3,

（1.武漢輕工大學生命科學與技術學院，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢 430023；3.湖北省生鮮食品工程技術研究中心，湖北武漢 430023）

免疫缺陷病（Immunodeficiency Disease, IDD）是由遺傳或者后天因素造成免疫系統受損，表現為免疫力低下，可使患者發生感染、腫瘤等惡性疾病的幾率大大增加。由遺傳因素引發的稱為原發性免疫缺陷病，主要由基因突變引發，包含STAT1、RAC2、IL6R等400 多種基因缺陷或突變[1]。獲得性免疫缺陷病多由病毒、惡性腫瘤、感染等后天性因素導致免疫功能出現暫時或永久性的損傷，如艾滋病。目前，針對免疫缺陷的治療手段如干細胞移植、免疫球蛋白替代療法以及抗病毒療法等可提高患者生存率，但治療費用昂貴，且相關技術手段不夠成熟[2-3]。

黃芪和女貞子既是傳統中醫藥又均被衛生部列入保健食品目錄，因具有良好的補益作用和豐富的營養價值，民間將其作為藥膳來應用，可用于治療免疫力低下，促進正常免疫功能的恢復，輔助治療由腫瘤或其他疾病引起的虛損[4-5]。有研究指出黃芪-女貞子聯合高效抗逆轉錄療法能更好地幫助艾滋病患者的免疫系統重建，能夠提高T細胞免疫水平，起到增強療效的作用，并可降低患者的骨髓抑制發生率[6-7]。黃芪-女貞子含有的黃酮、多糖、皂苷、三萜、環烯醚萜等活性成分，對免疫系統有諸多調節功能，能夠增強體液免疫和細胞免疫等能力[8-9]，在治療IDD上具有很大的潛力，但黃芪、女貞子治療IDD的具體機制尚未明確。

網絡藥理學結合計算機分析、生物信息學等多學科，通過構建網絡分析各種化合物與網絡中關鍵節點之間的關系以此顯示中藥的物質基礎和作用機制，其整體性和系統性與中藥多個成分作用不同靶點特點基本吻合[10-11]。本研究擬通過網絡藥理學篩選黃芪-女貞子干預IDD的潛在成分和作用靶點，分析潛在靶點參與的生物過程和通路，來解釋黃芪-女貞子輔助治療IDD的作用機制。為開發IDD患者膳食補充劑提供理論依據。

1 研究方法

1.1 黃芪-女貞子活性成分篩選

在中藥系統藥理數據庫及分析平臺TCMSP數據庫[12]中搜集黃芪-女貞子中化學成分，以OB≥30%，DL≥0.18（OB：口服生物利用度，DL：類藥性）作為標準來搜集活性化合物，同時查找相關文獻對沒入選但有相關活性研究的成分進行補充，以此建立黃芪-女貞子活性成分數據庫。

1.2 活性成分靶點預測及疾病靶點搜集

各個活性成分.mol2格式文件來源于TCMSP數據庫，然后轉化為SMILES文件，TCMSP數據庫未檢索到的化合物到PubChem數據庫下載SDF文件，再在Swiss Tagert Prediction數據庫[13]上傳各活性成分SMILES或SDF文件預測各化合物靶點（Probability＞0），并以此建立黃芪-女貞子的活性成分靶點文件，在GeneCards數據庫查找“Immunodeficiency disease”搜集相關靶點（Relevance score＞20）。將活性成分預測靶點與疾病靶點繪制韋恩圖取交集為黃芪-女貞子治療IDD的潛在靶點。

1.3 “活性成分-靶點-疾病”網絡圖的構建

獲取來的活性成分、潛在靶點和疾病靶點信息借助Cytoscape_v3.7.1將三者之間的關系構建成網絡圖來闡述黃芪-女貞子治療IDD的有效機制。

1.4 蛋白互作（PPI）網絡構建

在STRING數據庫中檢索黃芪-女貞子治療IDD 的潛在81 個靶點，設置目標為智人（Homo sapiens），選擇置信度“evidence”，相互作用評分大于0.9，隱藏游離節點，找到TSV文件并下載，用Cytoscape_v3.7.1打開進行拓撲學分析。

1.5 GO和KEGG富集分析

基于DAVID 6.8平臺進行交集基因的GO和KEGG通路富集分析，GO分析包括生物過程、分子功能和細胞組分（BP、MF、CC），全部選擇P值＜0.05和FDR＜0.05的條目，得到潛在靶點參與的過程和作用通路，并根據P值排序選取靠前條目利用微生信平臺[10]進行柱狀圖和氣泡圖可視化繪制。利用Cytoscape_v3.7.1的ClueGo和Cluepedia的插件對交集靶基因分析GO免疫系統過程，選擇使用GO術語融合和限制P值≤0.05，設置Level最小為4最大為7、最小富集基因數為3、Kappa Score為0.4，并構建靶點-免疫過程網絡圖。

1.6 分子對接

取PPI網絡中Degree（度）值排名前5作為受體蛋白，“活性成分-靶點-疾病”網絡中活性成分節點度值排名靠前作為配體分子，登錄PDB數據庫[14]下載受體蛋白結構，利用PyMOL-2.3.4及AutoDockTools軟件對蛋白和配體分子進行前處理，然后引用Vina進行分子對接預測配體小分子與蛋白結合能，選擇最低結合能為最優構象。將受體配體對接文件經PyMOL處理后上傳至Plip在線網站將驗證結果進行可視化。

2 結果與分析

2.1 藥物化學成分篩選

在TCMSP數據庫中黃芪（HQ）檢索到20種化合物，女貞子（NZZ）檢索到13種化合物，兩味藥共檢索到31 種化合物，包括白樺脂酸、華良姜素、常春藤皂苷元等，其中，槲皮素（A1）和山奈酚（A2）為兩味藥共有成分，同時查找文獻發現黃芪中黃芪多糖、黃芪總皂苷以及女貞子中的齊墩果酸、熊果酸、紅景天苷對免疫有調節作用[9,15-16]，故將以上成分補充共計36種成分建立黃芪-女貞子活性成分數據集，見表1。

表1 黃芪-女貞子活性成分信息Table 1 Information on active components of Astragalus and Ligustrum lucidum

2.2 活性成分靶點和疾病靶點

Swiss Tagert Prediction平臺得到黃芪22個成分對應429個靶點，女貞子16個成分對應491個靶點，將黃芪、女貞子對應靶點合并刪除重復值共得到有效靶點491個，在GeneCards數據庫得到免疫缺陷病相關靶點共609個，與黃芪-女貞子預測靶點共有靶點81個包括TNF和ADA等，見圖1和表2。

表2 黃芪-女貞子治療IDD潛在靶點Table 2 Potential target of Astragalus and Ligustrum lucidum in the treatment of IDD

圖1 黃芪-女貞子靶點和免疫缺陷病靶點韋恩圖Fig.1 Wayne diagram of Astragalus-Ligustrum lucidum target and immunodeficiency disease target

2.3 “活性成分-潛在靶點-疾病”網絡關系圖

利用Cytoscape_v3.7.1軟件繪制黃芪-女貞子治療IDD的“活性成分-靶點-疾病”網絡圖（如圖2）。網絡圖共涉及Nodes（節點）113個，Edges（邊）428條。圖中黃色方塊代表黃芪活性成分，綠色方塊代表女貞子活性成分，紅色圓圈代表黃芪-女貞子共有成分，藍色菱形代表藥物干預疾病潛在靶點，紫色三角代表疾病，以degree值大小設置節點面積大小并按大小順序進行排列篩選，排名前5的活性成分為NZZ11（木犀草素）、HQ16（異琥珀酰氨醇）、HQ10（美迪紫檀素）、HQ2（華良姜素）和A2（山奈酚），推測這些化合物可能是黃芪-女貞子治療免疫缺陷病的主要活性成分。

圖2 活性成分-潛在靶點-疾病網絡圖Fig.2 Active ingredients-potential targets-disease network diagram

從網絡圖中可以預測黃芪-女貞子36個成分中共有31個活性成分可作用于IDD，另外5種成分沒有對應IDD靶點，其中，多數成分在已有研究中具有良好的免疫調節作用。如槲皮素除了可以增強環磷酰胺（CTX）的抗腫瘤作用，還可以提高免疫缺陷小鼠的外周血白細胞數目和巨噬細胞吞噬作用，促進T細胞、B細胞增殖來修復CTX所造成的免疫抑制[17-18]；山奈酚可以抑制小鼠淋巴細胞凋亡和活化的促炎因子，提高淋巴細胞活力，增加抗炎細胞因子和CD4+T水平（T淋巴細胞）來提高免疫力[19-20]；紅景天苷可以促進小鼠T/B淋巴細胞增值率，從而提高免疫功能[21]，可以增加宿主RIG-I等天然免疫因子，提高宿主免疫力，同時可激活IRF-3基因，增加Ⅰ型干擾素的表達以發揮其抗病毒作用[22]；季宇彬等[23]研究發現腫瘤模型小鼠經黃芪多糖給藥后可有助于其改善紅細胞生理功能，增強紅細胞CR1免疫活性、恢復免疫功能；圣草酚具有一定的抗氧化活性，可以增強NK細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞的殺傷活性發揮免疫調節作用[24]。IDD患者免疫系統受損，而這些活性物質可以增強B細胞、巨噬細胞等免疫細胞活性，推測黃芪-女貞子可通過激活免疫系統來干預IDD。異鼠李素可抑制金黃色葡萄球菌的α溶血素表達而產生一定的抑菌作用[25]；木犀草素可降低IL-6和TNF-α的表達來降低大腸埃希菌對呼吸道上皮細胞的感染，還可以影響一些參與自噬的信號分子以阻止癌癥的發展，如促進Beclin-1的表達刺激細胞自噬來誘導肝癌細胞死亡[26-27]。IDD患者由于免疫屏障被破壞從而會引發惡性腫瘤、感染、自身免疫性疾病等復雜性疾病，如上述，不同有效活性成分具有不同藥理作用，不僅能夠調節免疫系統，還有抑制腫瘤、抗感染等作用，體現了中藥干預疾病發展的整體性和綜合性。

2.4 PPI網絡構建

將STRING數據庫中檢索到的81個潛在靶點繪制成PPI網絡圖（如圖3），該網絡圖包含73個節點和293條邊，平均節點度值為8，有8個游離節點被隱藏。圓形節點大小表示度（degree）值，連線粗細和顏色深淺表示結合分數，度值越大表示該靶點越關鍵，根據PPI網絡圖分析可知，MAPK1、PIK3CA、STAT3、PIK3R1、SRC、AKT1、HRAS等靶點可能是黃芪-女貞子治療IDD的關鍵靶點。

圖3 黃芪-女貞子治療IDD靶點蛋白相互作用網絡圖Fig.3 Target protein interaction network diagram of Astragalus-Ligustrum lucidum in the treatment of IDD

IDD的主要原因在于免疫系統遭到破壞從而導致系統疾病，因此，治療IDD的重點在于幫助患者免疫重建，同時對于由免疫缺陷而引發的病癥也進行對癥治療，如炎癥、腫瘤等[2]。信號傳導與轉錄激活因子-3（STAT3）是細胞存活和凋亡的關鍵調節因子，其可參與IL-6信號通道和誘導IL-17A、IL23受體、干擾素調節因子4等與Th-17細胞分化和增殖等相關基因的表達，STAT3的過度激活會影響T細胞發育造成免疫抑制，影響促炎介質的產生和抑制抗原呈現從而降低免疫細胞的抗腫瘤作用[28-29]，同時STAT3突變也會導致IDD的發生[30]，SRC家族激酶是非受體酪氨酸激酶，包含Lck、Fyn、Lyn等具有相似結構功能的成員，在免疫應答等生理過程有重要作用[31]，相關研究指出SRC家族激酶作為一個整體參與了人外周血T細胞抗原受體的下調，抑制Lck和Fyn的表達會損傷T細胞的激活和效應功能[32]。AKT1參與調節細胞功能，JIA等[33]發現AKT1參與抑制HIF-α依賴的糖酵解途徑來調節髓源性抑制細胞的免疫抑制活性，對炎癥損傷有保護作用。這些靶點主要涉及免疫細胞增殖分化和炎癥反應的調控，推測黃芪-女貞子活性成分通過作用于這些靶點來減輕免疫抑制，促進免疫細胞發育，以及抗腫瘤從而綜合干預IDD。

2.5 GO富集分析和KEGG富集分析

DAVID 6.8平臺中通過選擇“Homo sapiens”限制P值＜0.05和FDR＜0.05得到81個交集基因涉及152條生物過程（Biological Process，BP），33條細胞組分（Cellular Component，CC），40條分子功能（Molecular Function，MF）。根據P值從小到大篩選BP、CC和MF排名前十繪制柱狀圖（如圖4）。生物過程主要涉及藥物反應，MAP激酶活性的正向調節和蛋白質磷酸化的正向調節等；細胞組分中主要影響細胞溶質、質膜、膜筏等；分子功能包括相同蛋白結合、不同蛋白結合、酶結合等。KEGG富集分析結果顯示81個交集基因涉及91條KEGG通路，同樣根據P值排序靠前的有Pathways in cancer、Prostate cancer、Glioma和Hepatitis B等通路 （如圖5）。此外，將黃芪-女貞子干預免疫缺陷病81個潛在靶點基因導入ClueGo插件進行GO免疫系統過程分析，得到36個靶點共涉及到α-βT細胞活化等23條免疫系統過程，見圖6。圖中方形排列代表黃芪-女貞子干預IDD的相關靶點，外圈圓形排列代表免疫系統過程。

圖4 黃芪-女貞子治療IDD靶點GO富集分析柱狀圖Fig.4 Histogram of GO enrichment analysis of Astragalus and Ligustrum lucidum in the treatment of IDD

圖5 黃芪-女貞子治療IDD靶點KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.5 Enrichment analysis of KEGG pathway in Astragalus and Ligustrum lucidum in the treatment of IDD

圖6 潛在靶點GO免疫系統過程網絡圖Fig.6 Network diagram of potential targets GO immune system process

GO富集分析表明黃芪-女貞子干預IDD涉及到藥物反應，MAP激酶活性的正向調節等生物過程，α-βT細胞活化、α-βT細胞分化等免疫系統過程，MAP激酶參與細胞生長、凋亡等一系列生理活動，如巖白菜素可以刺激巨噬細胞MAP激酶激活產生抗分岐桿菌效應分子從而給宿主提供免疫保護[34]；KEGG富集分析顯示癌癥途徑、癌癥中的蛋白質、乙肝、ErbB信號通路、HIF-1信號等通路可能是黃芪-女貞子干預免疫缺陷病的關鍵通路。有研究表明下調HIF-1信號通路可抑制腫瘤細胞增殖分化[35]，鄧哲[36]發現薯蕷丸可通過HIF-1α信號通路增加腫瘤淋巴細胞CD8和CD4表達來殺死癌細胞。GO免疫系統過程分析結果顯示黃芪-女貞子可通過參與α-βT細胞活化等過程調節免疫系統。本研究推測黃芪-女貞子參與多個生物過程和免疫過程，通過免疫和癌癥相關通路綜合作用于免疫缺陷病。

2.6 分子對接驗證

為了驗證黃芪-女貞子活性成分對其干預疾病潛在靶點作用的可能性，選取了MAPK1、PIK3CA、STAT3、PIK3C1和SRC作為受體（PPI網絡圖節點排名前五），在PDB數據庫下載受體蛋白晶體文件：MAPK1（PDB ID:4zxt）、PIK3CA（PDB ID:6pys）、STAT3（PDB ID:6njs）、PIK3C1（PDB ID:5sxb）和SRC（PDB ID:2bdj），根據受體蛋白原配體確定對接口袋，和圖2中度值排名前5的活性成分（NZZ11、HQ10、HQ16、HQ2、A2）在Vina軟件中進行25次分子對接預測了靶點與成分之間的結合能（kcal/mol），見圖7。

圖7 主要活性成分與關鍵靶點分子對接結合能熱圖Fig.7 Heat map of docking binding energy between main active components and key target molecules

一般認為配體和受體結合能為負數就表示它們之間可以結合，結合能越小，其對接活性越大，發生作用的可能性越大，結合能小于-5 kcal/mol就代表兩者之間有良好的結合性。對接結果顯示A2（山奈酚）與SRC（2bdj）結合能最低，為-9.6 Kcal/mol，其次是NZZ11（木犀草素）與SRC（2bdj），結合能為-9.4 Kcal/mol，NZZ11（木犀草素）與PIK3CA（6pys），結合能為-8.9 Kcal/mol，將它們對接模式進行可視化（如圖8）。A2（山奈酚）與SRC蛋白的LEU-273、VAL-281、LYS-295等氨基酸殘基形成疏水作用，與LYS-295、MET-341和GLY-344形成氫鍵，見圖8A；NZZ11（木犀草素）與SRC蛋白的VAL-281、ALA-293、LYS-295等氨基酸殘基形成疏水作用，與LYS-295、GLU-310、MET-341、GLY-344和ASP-404形成氫鍵，見圖8B；NZZ11（木犀草素）與PIK3CA蛋白的TRP-780、ILE-800、TYR-836等氨基酸殘基形成疏水作用，與LYS-802、ASP-810、VAL-851和SER-854氨基酸殘基形成氫鍵作用，見圖8C。分子對接結果顯示黃芪-女貞子的主要活性成分可以很好地與預測的主要潛在靶點結合在一起，驗證了這些成分治療IDD的可能性。

圖8 結合活性較好的化合物與靶點蛋白分子對接示意圖Fig.8 Schematic diagram of docking of compounds with good binding activity with target protein molecules

3 結論

本研究利用網絡藥理學相關理論初步研究黃芪-女貞子治療IDD的活性成分、潛在靶點和作用途徑，黃芪-女貞子中木犀草素和槲皮素等活性成分作用于MAPK1、PIK3CA、STAT3等關鍵靶點，通過免疫和癌癥相關通路綜合發揮輔助治療免疫缺陷病的作用。分子對接預測黃芪-女貞子主要活性成分與IDD關鍵靶點的結合能較低，具有良好的結合活性。黃芪-女貞子不僅能調節免疫系統還有抗感染、抗腫瘤等作用，體現了其在干預免疫缺陷病時具有整體性、系統性特點，和中醫在診治疾病的標本兼顧的思想基本吻合。本文初步解釋黃芪-女貞子在免疫缺陷病作用機制，為后續研究提供研究思路和方向，也為將黃芪-女貞子開發成調節免疫缺陷病患者身體機能的膳食補充劑提供參考。