人參皂苷Rb1對改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂的作用

朱 謀，鞏曉晨，劉冬陽，王瀠婉琪，李 林，王小龍, ，張春晶,

（1.齊齊哈爾醫學院醫學技術學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江中醫藥大學國際教育學院，黑龍江哈爾濱 150040）

2型糖尿病（T2DM）屬于非胰島素依賴型糖尿病（NIDDM），以高血糖、胰島素抵抗、低級別炎癥為主要特征，是一種影響糖、脂、蛋白質代謝的慢性代謝性疾病[1-3]，這種慢性代謝性疾病被認為是由遺傳和環境的交互作用引起的。目前，糖尿病的治療手段主要以口服降糖藥物或注射胰島素為主的西藥治療[4]，用于治療T2DM的藥物有：胰島素、雙胍類、胰高血糖素樣肽（GLP-1）、磺脲類、噻唑烷二酮類等[5-7]。目前上述各類藥物在使用過程中均有不良反應的報道。而中醫藥改善T2DM具有療效顯著、不良反應小等優點，目前已成為T2DM治療領域的研究熱點。

近年來發現的具有改善胰島素抵抗（IR）作用的中藥活性成分有萜類、黃酮類、生物堿類、多糖核苷類等，它們可通過抑制氧化應激、抵抗炎癥反應、促進葡萄糖轉運等多種方式降低血糖，緩解T2DM胰島素抵抗的癥狀。人參包含有30多種皂苷，其中人參皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1）被認為是人參中最豐富和最重要的四環三萜類皂苷，其對心血管系統、內分泌系統、神經系統等有明顯的作用效果[8]。張志良等[9]研究發現人參皂苷Rb1可以顯著改善糖尿病大鼠心肌細胞的凋亡，改善糖尿病心肌病的預后。趙丹丹等[10]通過構建肥胖模型小鼠，研究發現人參皂苷Rb1能通過激活骨骼肌AMPK信號通路相關蛋白，達到減輕肥胖小鼠體質量并降低血脂水平的目的。近年來一系列的細胞和動物實驗證明人參皂苷Rb1具有降糖和胰島素增敏作用[11-12]。但人參皂苷Rb1改善T2DM氧化應激和炎癥因子表達的作用目前還沒有系統的研究。本實驗主要研究G-Rb1對T2DM大鼠糖脂代謝紊亂、氧化應激和促炎因子的影響，以期為糖尿病的治療提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級雄性SD大鼠 48只，體重（200±20）g，動物實驗在齊齊哈爾醫學院實驗動物中心進行，動物飼養許可證（SYXK（黑）2016-001），在溫度（22±2）℃、濕度35%自動空氣清潔設備條件下飼養，整個實驗期間自由飲水攝食，適應性飼養1周，晝夜節律正常；人參皂苷Rb1（含量＞98%） 索萊寶科技有限公司；鏈脲佐菌素（STZ） Osharp公司；二甲雙胍（0.5 g/片） 施貴寶制藥有限公司；血清生化檢測指標試劑盒、ELISA檢測試劑盒 南京建成生物科技有限公司。

580/590血糖測定儀及其配套的血糖試紙 江蘇魚躍醫療設備股份有限公司；754 紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；Infinite M Plex多功能微孔檢測酶標儀 瑞士Tecan公司；MS200多管渦旋震蕩儀 杭州瑞成儀器有限公司；Centrifuge 5424R小型高速冷凍離心機 德國艾本德股份公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及T2DM大鼠模型的建立 48只SPF級雄性SD大鼠進行1周適應生活后，隨機分為對照組（NC，n=8）和高脂高糖飲食組（n=40），每8只相同組的小鼠被單獨關在一個籠子里。高脂飼料喂養4周后，禁食1晚（12 h），腹腔注射鏈脲佐菌素，劑量為35 mg/（kg·bw）[13-14]；對照組大鼠注射相同體積的緩沖液。STZ注射5 d后，禁食不禁水12 h后，空腹血糖水平超過11.1 mmol/L被確診2型糖尿病（T2DM）模型，隨機分為5組（每組n=8）：2型糖尿病模型組（MD）；人參皂苷Rb1高劑量給藥組（Rb1-H）；人參皂苷Rb1中劑量給藥組（Rb1-M）；人參皂苷Rb1低劑量給藥組（Rb1-L）；二甲雙胍對照組（MET）。治療組每日灌胃1次，Rb1-L組、Rb1-M組和Rb1-H組給藥劑量分別為15、30、45 mg/（kg·bw）[11]，二甲雙胍對照組每日灌胃1次45 mg/（kg·bw）的二甲雙胍，連續給藥8周。

1.2.2 大鼠體重及血糖的測定 在SD大鼠造模前、造模后及給藥第8周測定一次大鼠體質量。在造模后及第8周給藥結束后測定空腹血糖（FBG），禁食不禁水12 h，尾尖采血[15]，測定FBG值并記錄。給大鼠灌胃葡萄糖溶液2.00 g/（kg·bw），于0、0.5、1、2 h測定血糖值，進行糖耐量（OGTT）檢測并繪制血糖-時間變化曲線，計算血糖曲線下面積（AUC）[16]。

1.2.3 大鼠血清胰島素（INS）測定及胰島素抵抗指數（HOMA-IR）測定 采用酶聯免疫吸附（ELISA）法嚴格按照試劑盒進行操作測定INS，并計算胰島素抵抗指數：HOMA-IR=FBG×INS/22.5[17]。

1.2.4 血清指標及肝功能指標的測定 第8周給藥結束后，收集大鼠全血，離心后取血清，測定血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST），檢測嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 肝臟組織氧化應激水平測定 末次給藥后，快速解剖后取肝臟組織在冰上剪碎，制備10%肝臟勻漿，按照1 g肝臟組織加入9 mL生理鹽水配置，放入勻漿器中制備，保存備用。氧化應激相關指標丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）應用酶標儀進行檢測，測定過程嚴格按照說明書進行。

1.2.6 血清及肝臟組織促炎因子測定 末次給藥后采集血清樣本及制備肝臟勻漿，按照試劑盒說明，應用酶標儀進行血清和肝臟促炎因子白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的測定。

解剖后，按照試劑盒說明書快速提取肝臟組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，應用實時定量PCR（real-time PCR）儀測定IL-6和TNF-α表達量。引物序列如下：TNF-α，F：5′-AGGGAATTGTGGCTCT GGT-3′，R：5′-AGGCCACTACTTCAGCGTCT-3′，擴增片段為190 bp；IL-6，F：5′-ATTCTGTCTCGAGCCC ACCA-3′，R：5′-AGGCAACTGGCTGGAAGTCT-3′，擴增片段為133 bp；GAPDH，F：5′-GACAAGATGGTG AACTGTCGGT-3′，R：5′-CTTTGGCATCGTGGAAG GGCTC-3′，擴增片段為108 bp。擴增條件為95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共進行38個循環[18]。

1.3 統計分析

采用SPSS20.0統計學軟件對研究數據進行統計分析，數據以“平均值±標準偏差”表示，單因素方差分析與Tukey多重比較檢驗比較組間差異，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同處理大鼠體重的變化

造模前，各組大鼠適應性喂養一周，平均體重在180.51～187.45 g之間，各組間大鼠體重沒有統計學差異（P＞0.05）；對照組（NC）大鼠一般性喂養，模型組（MD）、二甲雙胍組（MET）和人參皂苷Rb1-L、Rb1-M、Rb1-H組高脂飼料喂養4周后，給予STZ注射造模后，各組大鼠體重均極顯著高于NC組（P＜0.01）；連續給藥8周后，NC組大鼠體重保持一定增長，糖尿病模型造模成功后，模型組的大鼠出現T2DM體重減輕臨床表現，大鼠體重極顯著低于NC組（P＜0.01）；對比MD組，MET、Rb1-M、Rb1-H組大鼠體重減輕緩慢，體重極顯著高于MD組（P＜0.01），Rb1-L組大鼠體重顯著低于MET組（P＜0.05），與MD組對比沒有統計學差異（P＞0.05），結果見表1。

表1 人參皂苷Rb1對T2DM模型大鼠體重的影響Table 1 Effect of ginsenoside Rb1 on body weight of T2DM model rats

2.2 人參皂苷Rb1對T2DM大鼠血糖的影響

空腹血糖能夠反應糖尿病患者的基本胰島功能，空腹血糖高于11.1 mmol/L 則被診斷為糖尿病；葡萄糖耐量實驗則可以很好地反應出機體對血糖的調節能力以及胰島β細胞的功能情況。人參多種活性物質均已被證實具有降低血糖、改善葡萄糖耐量的作用，其作用機制涉及糖脂代謝途徑多個方面[18-20]。由表2可知，STZ注射造模后，模型組大鼠空腹血糖均大于11.1 mmol/L，說明造模成功。連續給藥后，對比MD組，Rb1-L、Rb1-M、Rb1-H組大鼠的FBG值均極顯著降低（P＜0.01），其中，Rb1-L、Rb1-M和Rb1-H組其降糖效應與化學藥物鹽酸二甲雙胍基本相當，人參皂苷高、中低劑量組的大鼠OGTT 0.5、1.0、2.0 h血糖值及AUC均明顯降低（P＜0.01），與MET組間沒有統計學差異（P＞0.05）。

表2 人參皂苷Rb1對大鼠FBG、OGTT及AUC的影響Table 2 Effects of ginsenoside Rb1 on FBG, OGTT and AUC of rats

2.3 人參皂苷Rb1對T2DM大鼠INS、HOMA-IR的影響

胰島功能受損和胰島素抵抗是2型糖尿病主要病理學特征之一，尚文斌等[21]研究指出，人參皂苷Rb1可以顯著改善糖尿病小鼠的胰島素敏感性指數，并且能夠增加脂肪細胞葡萄糖的消耗利用，對血糖降低具有一定的作用。

本研究結果顯示（見圖1），與NC組相比，MD組大鼠的血清胰島素水平、胰島素抵抗指數均極顯著增高（P＜0.01）；與MD相比，Rb1-L胰島素水平沒有統計學差異（P＞0.05），Rb1-M和Rb1-H組胰島素、胰島素抵抗指數均極顯著降低（P＜0.01）；與MET組相比，Rb1-M和Rb1-H胰島素水平沒有統計學差異（P＞0.05），而Rb1-L胰島素水平顯著高于MET組（P＜0.05）。HOMA-IR不同給藥組間沒有統計學差異（P＞0.05），與MD組比較HOMA-IR極顯著降低（P＜0.01）。結果顯示人參皂苷Rb1可以顯著改善糖尿病小鼠的胰島素分泌水平，并有效降低胰島素抵抗指數。

圖1 人參皂苷Rb1對血清胰島素、胰島素抵抗指數的影響Fig.1 Effect of ginsenoside Rb1 on serum insulin and insulin resistance index of rats

2.4 人參皂苷Rb1對T2DM大鼠血清血脂及肝功能指標的影響

2型糖尿病患者大多數是肥胖人群，并且伴有機體糖脂代謝的紊亂，血液中除血糖會升高外，甘油三酯、膽固醇及低密度脂蛋白含量均會顯著升高，而起保護作用的高密度脂蛋白濃度下降。過多的脂肪積累不僅會誘發糖尿病的發生，也會導致肝臟損傷的發生[22-23]。臨床上常將AST和ALT作為評價肝功能的聯合檢測指標。LIU等[24]研究結果表明人參皂苷Rg1能夠有效降低高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型總膽固醇、總甘油三酯含量，通過誘導AMPK活化減少脂質沉積達到保護肝臟的作用。

本研究結果表明，與NC組相比，模型組TC、TG、LDL-C含量和ALT、AST活性極顯著增高（P＜0.01），HDL-C含量極顯著減少（P＜0.01），說明模型組大鼠出現脂代謝異常；與MD組相比，人參皂苷Rb1各給藥組TC和TG含量顯著降低（P＜0.05），ALT、AST活性極顯著降低（P＜0.01），HDL-C含量顯著增多（P＜0.05），Rb1-L組LDL-C的含量與MD組沒有統計學差異（P＞0.05）；與MET組對比，Rb1-L組TC和ALT、AST活性顯著高于MET組（P＜0.05），HDL-C含量極顯著低于MET組（P＜0.01）。結果提示人參皂苷Rb1能夠有效改善糖尿病大鼠脂代謝異常，與曹萌[25]研究結果一致。并且中、高劑量給藥組改善效果優于低劑量給藥組，結果見表3。

表3 人參皂苷Rb1對大鼠血清生化指標的影響Table 3 Effects of ginsenoside Rb1 on serum biochemical indexes of rats

2.5 人參皂苷Rb1對T2DM大鼠氧化應激水平的影響

相關研究表明通過調節氧化應激通路中的相關分子可以改善胰島細胞的功能，促進葡萄糖的代謝，減少對肝組織的損傷[26-27]。研究發現T2DM患者體內MDA含量增多、SOD活性減弱，氧化應激升高[28]，同時體內氧化應激反應的有效抑制可以減輕糖尿病病癥。

由表4可知，與NC組相比，MD組MDA水平極顯著增高（P＜0.01）；CAT、SOD和GSH-Px水平極顯著降低（P＜0.01）；與MD組相比，各給藥組MDA水平極顯著降低（P＜0.01），SOD活力極顯著升高（P＜0.01），Rb1-M和Rb1-H組CAT和GSH-Px活性極顯著升高（P＜0.01），Rb1-L組與MD組沒有統計學差異（P＞0.05）。與MET組相比，Rb1-L組MDA水平極顯著高于MET組（P＜0.01），CAT、SOD和GSH-Px活性不同給藥組間無統計學差異（P＞0.05）。結果提示，人參皂苷Rb1中、高劑量給藥組對降低大鼠氧化應激反應的作用優于低劑量給藥組，表明人參皂苷Rb1能夠抑制T2DM大鼠氧化應激反應，起到保護作用。

表4 人參皂苷Rb1對大鼠氧化應激水平的影響Table 4 Effects of ginsenoside Rb1 on oxidative stress of rats

2.6 人參皂苷Rb1對T2DM大鼠血清和肝臟IL-6，TNF-α的影響

本研究分別應用ELISA法測定了血清及肝臟組織促炎因子IL-6、TNF-α的含量（如圖2），并應用real-time PCR法檢測了肝臟組織兩種炎癥因子的mRNA表達水平。ELISA法研究結果發現，與NC組相比，MD組血清和肝臟中IL-6、TNF-α極顯著升高（P＜0.01）；與MD組相比，Rb1-M和Rb1-H組血清和肝臟中IL-6、TNF-α極顯著降低（P＜0.01），Rb1-L組血清TNF-α和肝臟IL-6、TNF-α與MD組間沒有統計學差異（P＞0.05）；與MET組相比，Rb1-L組血清IL-6、TNF-α及肝臟TNF-α顯著高于MET組（P＜0.05），Rb1-M和Rb1-H組與MET組間無統計學差異（P＞0.05）。結果提示，人參皂苷Rb1低劑量給藥對血清促炎因子指標作用不明顯，中、高劑量給藥藥效與二甲雙胍相近。Real-time PCR法檢測結果與ELISA法相近，其中與MD組相比，人參皂苷給藥組均能顯著降低肝臟中IL-6、TNF-α表達水平（P＜0.05）。

圖2 人參皂苷Rb1對T2DM大鼠血清和肝臟組織中IL-6、TNF-α水平的影響Fig.2 Effects of ginsenoside Rb1 on IL-6 and TNF-α levels in serum and liver of T2DM rats

TNF-α和IL-6是由多種炎癥細胞合成并分泌的炎癥因子。T2DM主要特征中包括慢性低級別炎癥，也是產生胰島素抵抗的主要發生機制。相關研究[29-30]均表明降低血清中TNF-α、IL-6的水平，可以降低胰島素抵抗。結合以上結果發現人參皂苷Rb1能夠減輕炎癥反應，并降低胰島素抵抗。

3 結論

本實驗采用高糖高脂飲食誘導，腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）構建2型糖尿病大鼠模型。研究人參皂苷Rb1對2型糖尿病大鼠的影響。結果表明人參皂苷Rb1可以有效地緩解T2DM大鼠體重減輕的癥狀，在實驗中，經過人參皂苷Rb1中、高劑量治療后，可顯著改善大鼠糖脂代謝異常，能夠顯著降低T2DM大鼠空腹血糖水平，提高葡萄糖耐量能力并有效改善胰島素抵抗；顯著降低血清TG、TC和LDL-C含量，提高HDL-C含量；人參皂苷Rb1給藥可緩解大鼠肝功能損傷，有效降低血清ALT和AST水平；能夠有效抑制氧化應激反應，顯著降低大鼠肝臟MDA水平，上調CAT、SOD和GSH-Px活性；同時可以降低大鼠血清及肝臟組織中炎癥因子TNF-α和IL-6的含量，揭示人參皂苷Rb1具有良好的抗氧化及抗炎活性。

總體來說，人參皂苷Rb1對改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝異常、抑制氧化應激反應、降低炎癥反應具有一定的治療效果，并以中、高劑量為佳。但其具體的降糖機制并未通過分子水平進行深入研究，未來應針對具體降糖機制進行重點研究，為人參皂苷Rb1的開發和利用提供實驗依據。