輻照處理對樺褐孔菌多糖抗疲勞作用的影響

路欣彤，齊 欣，高雪峰 ，崔承弼,,

（1.延邊大學農學院，吉林延吉 133000；2.延邊大學藥學院，吉林延吉 133000；3.延邊韓工坊健康制品有限公司，吉林延吉 133000）

疲勞是人體非常復雜的生理狀態，隨著社會壓力的增大，許多人的身體處于一種亞健康的狀態[1]。在神經系統疾病中，在多發性硬化癥、腦出血以及神經肌肉等疾病中，疲勞患者的患病率會增加[2]。首先，肌肉疲勞是由于乳酸和尿素氮等代謝物的過度產生和積累導致的[3]；其次，肌肉或其他相關器官（如肝臟）中活性氧的產生導致氧化應激和對身體的損害，最終機體在無氧運動狀態下，通過糖酵解反應獲取能量，此運動下產生乳酸，乳酸含量的增多，導致疲勞狀況的發生[4]。一些化學藥物和天然草藥，如黃芪、蛹蟲草和紅景天等[5]均已被報道具有抗疲勞作用。因此，有必要對天然抗疲勞的活性物質進行研究與開發[6]。

樺褐孔菌（Inonotus obliquus），屬于多孔菌科褐臥孔菌屬，是一種藥食兩用的木腐菌[7]，又名樺樹茸、西伯利亞靈芝[8]等，無任何毒副作用，主要產于北緯45°～50°的俄羅斯、吉林長白山、日本北海道等地[9-11]。樺褐孔菌中，多糖是其主要的活性成分[12]。目前，來自于各種植物、動物、微生物的多糖，因純天然、藥理活性強、無毒副作用、易于藥物質量控制等優點[13]而受到廣泛重視，是一種潛在的保健功能成分。此外，許多研究表明，樺褐孔菌含有200多種活性物質，其含有的多糖、樺褐孔菌素、三萜類化合物等，具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、抗疲勞、促進益生菌增殖等功效[14-16]。

樺褐孔菌因外界吸收了化學物質成分而導致其在長期的保存和加工過程中營養成分受到影響，一些有機生物的物質成分也發生變化，所以必須對其進行凈化處理[17]。輻照是一種新興的食品保鮮技術，目的是提高食品安全[18-19]。主要運用在殺菌誘變等方面[20]，60Co產生的γ-射線可以與食品相互作用使其發生生理生化反應或生物效應，可通過這種輻照方式提高食品中活性物質各方面的特性[21]。食品經過輻照處理后，對于微量元素、氨基酸、蛋白質以及糖類損失較少，達到消滅食品或農產品中的微生物，如病毒、細菌等的目的。此外，輻照有助于提高衛生和安全性[22]。陳浙婭等[23]研究輻照對裂褶菌多糖提取、分子量及生物活性的影響，發現在一定劑量范圍內，隨著輻照劑量的增加，裂褶菌多糖的提取率和純度有顯著增加。因此，本實驗在前期研究的基礎上將選定最優輻照劑量，選擇經60Co-γ射線輻照后的樺褐孔菌與未輻照樺褐孔菌制得多糖，研究其對小鼠的抗疲勞效果，為輻照樺褐孔菌多糖在抗疲勞方面的開發與利用提供理論性參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性昆明種小鼠30只，體重（19±1）g 延邊大學動物實驗中心（生產許可證號：SCXK（吉）2009-0003）；樺褐孔菌干樣 長白山科學研究院提供并于四川省原子能研究院進行輻照處理；乙醇（85%）、濃硫酸（98%） 天津市科密歐化學試劑有限公司；葡萄糖粉劑 廣西梧州制藥（集團）股份有限公司；MDA、SOD、SUN試劑盒、糖原測試盒、乳酸（LD）測試盒、乳酸脫氫酶 （LDH）測試盒 南京建成生物工程研究所。

60Co-γ輻照源 四川省原子能研究院；DF-35型落地式連續投料粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司; ScoutSE-SE202FZH型電子天平 常州奧豪斯儀器有限公司；TG16A-WS型離心機 上海盧湘儀器有限公司；CCA-1111-CE 型旋蒸冷凝器 東京理化器械株式會社；LyoQuest-55實驗型冷凍干燥機西班牙Telstar 集團公司；DTC-22B型真空泵 日本ULUACKIKO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樺褐孔菌材料處理 將樺褐孔菌破碎，用40目型粉碎機進行粉碎成樺褐孔菌粉末。將樺褐孔菌粉末送至四川省原子能研究院進行輻照處理，以60Co-γ射線為輻照源，根據前期實驗設計輻照劑量分別設為 5、 10、20、30 kGy，每組樺褐孔菌劑量率均為 1 kGy/h，輻射距離 37 cm，平鋪厚度3 mm，重鉻酸鉀劑量計進行劑量追蹤，輻照時間分別為 5、10、20、30 h，重復三次。輻照處理后的樺褐孔菌置于冰箱冷藏室內 4 ℃貯存備用。

1.2.2 樺褐孔菌多糖的提取 根據多項研究證實，使用乙醚或乙醇等有機溶液，可以脫去多糖中的脂類，防止多糖降解及含量的減少[24]。利用熱水浸提法，取不同輻照劑量（5、10、20、30 kGy）樺褐孔菌菌粉各10 g分別放入四個燒杯中，未輻照的樺褐孔菌菌粉10 g放入一個燒杯中，分別加入85%的乙醇（500 mL）并充分混合，80 ℃水浴2.5 h，冷卻達到室溫，3500 r/min離心5 min，抽濾取清液后旋蒸，置于平皿中充分凍干，即得粗多糖粉末。

1.2.3 最優輻照劑量的選定

1.2.3.1 葡萄糖標準曲線的測定 稱取葡萄糖粉末5 mg，定容至50 mL，配制成0.1 mg/mL的母液，取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖溶液，后在各個燒杯中分別進行如下操作：用蒸餾水填補到1 mL，加苯酚0.6 mL，濃硫酸3.6 mL，混合均勻，100 ℃水浴顯色20 min，降至室溫并測得490 nm處的OD值，得到葡萄糖的標準曲線。

1.2.3.2 輻照劑量選定 樺褐孔菌經過提取過程獲得多糖粉末后，稱量輻照后的樺褐孔菌多糖粉末和未輻照粉末各1 mg，分別進行以下操作：使用蒸餾水定容至10 mL，混合試劑后，取1 mL，加入苯酚和濃硫酸，全部混合，高溫水浴20 min，降至室溫并測得490 nm處的OD值。測定樺褐孔菌多糖含量，確定最佳輻照劑量。

1.2.4 實驗動物分組及給藥 選取體重（19±1）g的SPF級雄性昆明種小鼠，適應性喂養7 d，按照體重隨機分成5組，每組6只，即空白對照組、60Co-γ射線最佳輻照劑量樺褐孔菌多糖低劑量組、中劑量組、高劑量組、未輻照樺褐孔菌多糖高劑量組。三種劑量分別為50、250、500 mg/kg·BW，空白對照組灌胃生理鹽水，小鼠灌胃劑量0.1 mL/10 g，實驗劑量的確定參考其他研究中的劑量[25]。每天記錄體重、糧重、水重，持續灌胃30 d。

1.2.5 小鼠試驗前后體重、體重增加量與進食量測定 根據中華人民共和國衛生部頒布的《保健食品檢驗與評價技術規范》[26]的要求每天記錄小鼠的體重、糧重、水重，喂養30 d后根據各組數據進行分析。

1.2.6 小鼠爬桿時間與力竭游泳時間測定 第30 d灌胃1 h后，進行爬桿實驗。準備有機棒，將爬桿架放入水深30 cm，水溫（26±2）℃水箱中進行實驗，使小鼠肌肉處于靜力緊張狀態，記錄從實驗開始到小鼠無力支撐從有機棒上掉落的時間[27]。按以上實驗方法，第3次跌落時終止實驗，累計3次的總時間作為爬桿時間，實驗結束后繼續飼養。測定完爬桿時間后，休息1 d，將小鼠放入水深約30 cm、水溫（26±2） ℃水箱中進行游泳實驗，使小鼠一直處于肌肉緊張狀態。小鼠力竭的時間判斷為頭部沉入水中10 s內不返回水面，記錄時間[28-29]，實驗重復三次。

1.2.7 小鼠肝糖原、肌糖原、全血乳酸含量與乳酸脫氫酶活性的測定 小鼠游泳結束后休息30 min，內眥取靜脈血。脫頸處死后解剖取出小鼠肝臟，除去結締組織。實驗操作方法根據試劑盒方法，進行測定肝糖原儲備量、肌糖原含量，測定全血乳酸含量[30]，測定血清中乳酸脫氫酶活性[31]。

1.2.8 小鼠血清尿素氮含量、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）測定 取游泳力竭后的立即處死的小鼠骨骼肌細胞，根據試劑盒說明要求制備成骨骼肌細胞勻漿。檢測血清尿素氮含量與骨骼肌中 SOD活力、MDA含量。

1.3 統計學分析

本實驗使用SPSS 23.0對整理后的實驗數據進行統計學分析，計算各組均值與標準偏差，進行顯著性差異分析。所得的數據以圖表和均值±標準偏差（±SD）的形式表示。P＜0.05表示有顯著性差異，P＞0.05表示無顯著性差異即無統計學意義。

2 結果與分析

2.1 樺褐孔菌多糖最佳輻照劑量的選定

經測定，標準曲線為y=0.3299x+0.1833（R2=0.986），多糖含量如下表所示，由表1得出，樺褐孔菌經60Co-γ輻照后，隨著輻照劑量的增大，多糖含量增加，且20 kGy處理增加最顯著（P＜0.05），可能是因為產物中含有酸性物質或含有羧基基團的物質，龔志華[32]通過對茯苓不同輻照劑量處理多糖相對分子量和組分分析表明，茯苓輻照后，水溶性總糖的數均相對分子質量（Mn）、重均相對分子質量（Mw）以及多分散系數（PI）均不同程度地增大；同時，茯苓輻照降解產物的多糖組成分析結果顯示：茯苓經1000 kGy輻照劑量處理后，降解產物主要是以酸性多糖為主。輻照劑量過高可能導致多糖分子結構發生改變，從而導致多糖含量下降。當輻照劑量為20 kGy時，樺褐孔菌菌粉中提取出的多糖含量最高，故本實驗選取輻照劑量為20 kGy的樺褐孔菌用于后續的動物實驗。

表1 不同輻照劑量處理后的多糖含量Table 1 Polysaccharide content after treatment with different irradiation doses

2.2 樺褐孔菌多糖對小鼠基礎指標的影響

2.2.1 小鼠實驗前后體重、增加量與進食量結果由表2結果可知，30 d灌胃藥品并未對小鼠體重有明顯影響，且未出現任何異常，各劑量組間動物體重增加量基本一致。其他四組攝食量比空白對照組高，灌胃組進水量相比于空白組較高，且在每天換一次墊料的條件下，與對照組相比，其他組墊料較濕潤，小鼠毛發柔順具有光澤，較活潑，且精力旺盛。結果表明，經灌胃后小鼠攝食量、進水量增加，且毛色更加有光澤。

表2 實驗前后小鼠指標結果Table 2 Mouse index results before and after the test

2.2.2 力竭游泳與爬桿時間研究結果 運動時間的長短，直接反映了藥物的效果，即抗疲勞效果。給藥組隨著給藥劑量的增加，爬桿時間與力竭游泳時間均有不同程度的增加。

結果如表3所示，與CK相比，輻照樺褐孔菌多糖的中、高劑量組與未輻照組小鼠力竭游泳和爬桿時間均有顯著差異（P＜0.05），CK與輻照低劑量組無顯著差異（P＞0.05）。由此說明，經樺褐孔菌多糖干預后小鼠游泳與爬桿運動時間均得到提高，其中，未輻照組與輻照高劑量組效果有顯著差異（P＜0.05）。曹利丹[33]通過小鼠負重游泳實驗結果得出樺褐孔菌多糖能夠顯著延長小鼠游泳時間。輻照高劑量組顯著增加了小鼠游泳和爬桿時間，因此，輻照樺褐孔菌多糖比未輻照樺褐孔菌多糖能更明顯地延長小鼠游泳與爬桿時間，且在500 mg / kg·BW（輻照高劑量）灌胃劑量下有效增加小鼠運動的時間。

表3 小鼠力竭游泳與爬桿時間結果Table 3 Mice exhausted swimming and pole climbing time results

2.2.3 小鼠肝糖原、肌糖原含量檢測結果 糖原是人體儲備能量的一種形式，在體內葡萄糖降低的時候能夠分解為葡萄糖供能，同時脂肪及蛋白質在葡萄糖降低的時候也會通過糖異生的途徑轉化為肝糖原從而提供能量。肌糖原的主要作用也是為機體提供能量。運動時體力衰竭是運動促進了糖原的消耗，為了維持糖原的水平，導致機體中糖原分解速度的加快[34]。

由表4可知，與CK比較，經樺褐孔菌多糖干預后的肌糖原含量均顯著升高（P＜0.05），CK與低劑量組對肝糖原含量無顯著差異（P＞0.05），這可能是由于輻照低劑量組灌胃劑量少，對肝糖原含量影響較小。高劑量組中肝糖原、肌糖原含量最高，且相同濃度作用下，未輻照組肝糖原、肌糖原含量顯著低于輻照組（P＜0.05）。黃鈴[35]通過小鼠灌胃樺褐孔菌多糖測定肝糖原含量得出，多糖各劑量組小鼠的肝糖原含量均高于對照組，證實了此實驗對抗疲勞效果的有效性，因此輻照樺褐孔菌多糖有能明顯增加小鼠肝糖原、肌糖原儲備量的作用。

表4 各組小鼠肝糖原、肌糖原含量Table 4 Contents of liver glycogen and muscle glycogen in each group of mice

2.2.4 小鼠全血中乳酸含量檢測結果 一般運動時機體會進行無氧呼吸，產生大量乳酸，造成缺氧，使得體內乳酸堆積，所以一般運動后會出現身體酸痛的情況，造成疲勞現象，所以產生乳酸的濃度與疲勞產生程度有很大的關系，且呈正比。

如表5所示，與CK相比，其他組乳酸含量均有所下降，且呈劑量依賴性。輻照樺褐孔菌多糖的低、中、高劑量組與未輻照組小鼠BLA含量均有顯著差異（P＜0.05），未輻照高劑量組與輻照高劑量組差異不顯著（P＞0.05）。ZHONG等[36]通過小鼠游泳實驗，證明了樺褐孔菌多糖能夠增加肝糖原含量，降低全血乳酸含量。從而可知，乳酸的產生會使機體產生疲勞現象，輻照樺褐孔菌多糖能夠降低小鼠乳酸含量，緩解運動中無氧呼吸造成的乳酸堆積現象。

表5 各組小鼠BLA含量Table 5 BLA content of mice in each group

2.2.5 小鼠血清中乳酸脫氫酶活性檢測結果 血清中的乳酸脫氫酶是一種體內能量代謝過程中產生的酶，在內臟等組織中廣泛存在。通過檢測乳酸脫氫酶的活性，可以有效為醫學病理學提供幫助，例如心腦血管病、動脈硬化及肝病等大多數疾病[37]。乳酸含量與清除乳酸的乳酸脫氫酶活性是評價機體疲勞和抗疲勞能力的重要指標。

如表6所示，與CK相比，其他組都增加了乳酸脫氫酶活性，輻照樺褐孔菌多糖的低、中、高劑量組與未輻照組小鼠LDH活性均有顯著差異（P＜0.05），未輻照組LDH活性顯著低于輻照組（P＜0.05），且輻照組呈濃度依賴性。乳酸脫氫酶能夠加速乳酸的代謝，維持機體乳酸平衡，從而減少機體中乳酸產生，減輕疲勞癥狀。此實驗證實輻照高劑量組對增強小鼠運動時LDH活性有顯著效果。

表6 各組小鼠血清中LDH活性Table 6 LDH activity in mouse serum of each group

2.2.6 小鼠血清尿素氮含量檢測結果 正常情況下，機體尿素的生成與排泄處于平衡狀態，機體經過長時間運動時不能獲得代謝所得的足夠能量，導致蛋白質、氨基酸的分解代謝水平上升，進而使血液中尿素氮含量有所上升[38]。機體的抗疲勞能力在一定程度上體現為減少機體中血清尿素氮含量。

如表7所示，與CK相比，輻照樺褐孔菌多糖的中、高劑量組與未輻照組血清尿素氮含量均有顯著差異（P＜0.05），隨著灌胃劑量的增加，血清尿素氮含量相應減少。CK組經過長時間運動后血清尿素氮含量迅速上升，輻照高劑量組能夠顯著降低血清尿素氮含量，且顯著低于未輻照高劑量組（P＜0.05）。實驗證明經過輻照樺褐孔菌多糖干預能夠有效降低血清尿素氮含量，緩解疲勞癥狀。

表7 各組小鼠血清尿素氮含量Table 7 Urea nitrogen content in mouse serum of each group

2.2.7 小鼠SOD活力、MDA含量檢測結果 機體運動時自由基增多，會導致細胞膜的結構與功能下降，產生疲勞，自由基與多不飽和脂肪酸反應形成過氧化脂質，代謝生成丙二醛（MDA）[39]。SOD是體內清除超氧陰離子自由基最重要的酶。

如表8所示，與CK相比，輻照樺褐孔菌多糖的中、高劑量組與未輻照組小鼠骨骼肌細胞中SOD活力、MDA含量均有顯著差異（P＜0.05），經過力竭測試后，小鼠骨骼肌中MDA含量上升，輻照高劑量組能夠顯著降低骨骼肌中MDA含量（P＜0.05），且顯著低于未輻照組；輻照高劑量組能夠顯著增加骨骼肌中SOD活性（P＜0.05），且顯著高于未輻照組，說明輻照樺褐孔菌多糖具有清除自由基的作用，從而減少代謝生成MDA，對自由基造成的機體損害具有保護作用。

表8 各組小鼠SOD活力、MDA含量Table 8 SOD activity and MDA content in mouse of each group

3 討論與結論

疲勞是一種疲憊和缺乏能量的亞健康狀態，已經成為影響世界20 %以上人口的嚴重問題。疲勞常分為中樞疲勞和外周疲勞，外周疲勞是指由于過度訓練而使肌肉功能下降從而導致的不良生理狀態[40]。據報道，組織糖原的消耗是外周疲勞的一個關鍵因素[41]。能量資源的持續供應和代謝副產物的消除可以恢復外周疲勞[42]。此外，體內氧化系統和抗氧化系統之間的平衡會被劇烈運動破壞，導致活性氧化物和丙二醛的過量產生。這些過氧化物也會導致身體疲勞[43]。

據報道，力竭性游泳運動會導致一些與疲勞有關的血液生化指標的變化，如乳酸和尿素氮[44]，碳水化合物糖酵解將葡萄糖轉化為乳酸。乳酸的過度積累導致肌肉和血液pH下降，并抑制糖酵解相關酶的產生和ATP的合成，導致肌肉疲勞。肝臟和骨骼肌中的糖原水平可以反映疲勞程度，糖原的水平直接決定了身體的運動耐力[45]。

本研究討論了輻照樺褐孔菌多糖對于小鼠抗疲勞能力的影響，結果表明，在5、10、20、30 kGy輻照劑量中，經過60Co-γ射線輻照處理后的樺褐孔菌菌粉，提取所獲得的多糖含量最多的為20 kGy下的輻照劑量。通過給小鼠灌胃輻照樺褐孔菌多糖，測定其對小鼠力竭游泳時間和相關抗疲勞的生化指標的影響，實驗表明，輻照樺褐孔菌多糖不會對小鼠的生長及發育造成不良影響，且可有效延長小鼠力竭游泳時長與爬桿時間，提高體內肝糖原和肌糖原的水平，增加LDH、SOD的活性，并有效延緩BLA、SUN及MDA的積累，且經60Co-γ射線輻照處理后的樺褐孔菌多糖作用要優于未輻照組，推測由于輻照后多糖含量增加，純度有所上升，營養物質得到保留。孫熙浛等[46]探討了60Co-γ射線輻照處理對紅景天乙醇提取物抗氧化及美白作用的影響，得出20 kGy 的60Co-γ射線輻照處理紅景天乙醇提取物的抗氧化活性最強，并具有良好的美白功效，提示輻照處理能夠提高植物活性。ZHANG等[47]通過游泳測試等相關指標測定發現樺褐孔菌多糖PIO-1不僅具有延緩身體疲勞的巨大潛力，而且改善精神疲勞。

綜上所述，經60Co-γ射線輻照處理后的樺褐孔菌多糖具有比未輻照樺褐孔菌多糖更好的抗疲勞活性，說明其能夠在一定程度上緩解疲勞癥狀，發揮其營養價值與保健功效，這為輻照樺褐孔菌多糖在抗疲勞方面的開發與利用提供理論性參考。