地參游離酚對CCl4所致肝細胞損傷細胞凋亡、細胞周期及炎癥因子的影響

李媛麗，洪 玥, ，孔 霄，林 琳，張天陽，李 望，劉 青，高春燕 ，盧躍紅

（1.大理大學公共衛生學院，云南大理 671000；2.大理白族自治州中醫醫院，云南大理 671000；3.北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川 750021）

肝臟在人類健康中起著至關重要的作用。當肝臟暴露于過量的某些有害物質中時，就會造成組織損傷、壞死及原有生物功能的喪失[1-2]。肝損傷伴肝代謝功能障礙可導致許多疾病，包括從肝酶水平的短暫升高到危及生命的肝纖維化、肝硬化，甚至肝腫瘤等[3]。目前，運用于治療肝損傷和預防的藥物有很多，但是，此類藥物都具有相對嚴重的毒副作用[4]。因此，來源于天然動植物中安全高效的活性成分，用于此類疾病的防治已成為現今研究者關注的焦點[5]。已有研究表明，酚類化合物具有多種生物學作用，如抗氧化、抗動脈硬化、抑制腫瘤、抑制微生物、影響酶活性、保護CCl4肝損傷等[6-11]。

地參（Lycopus lucidusTurcz.），唇形科屬多年草本植物，其形狀、營養與人參相似[12]。地參含有礦物質、氨基酸、黃酮類、酚類和糖類等多種活性成分，具有增強免疫、抗氧化、降血糖、降血脂、抑制消化酶活性及抗腫瘤等作用[13-16]。前期研究結果顯示，在體內動物實驗中，地參游離酚提取物通過抗氧化、抗炎發揮對CCl4所致肝損傷小鼠的保護作用[17]；在體外細胞實驗中，地參酚類化合物能顯著降低CCl4所致BRL肝細胞損傷谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和乳酸脫氫酶（LDH）活性的升高[17-19]，但其作用機制尚不清楚，而CCl4所致肝損傷與細胞凋亡[20]、細胞周期的分布[21]、炎癥反應[22]等密切相關。

本研究通過建立CCl4所致BRL大鼠肝細胞損傷模型，采用流式細胞術分析細胞凋亡及細胞周期分布，檢測炎癥反應的介質因子腫瘤壞死因子α（TNFα）和白介素8（IL-8）的含量、Caspase-3的活化程度以及環氧化酶-2（COX-2）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和白介素6（IL-6）的蛋白表達水平，從細胞及分子水平揭示地參游離酚對CCl4所致BRL大鼠肝細胞損傷的保護作用機制，并作為開發地參保肝功能性食品及藥品的前期基礎研究，為地參資源的開發與利用和保肝藥物的開發提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地參 2019年10月采于云南省劍川縣沙溪鎮；BRL大鼠肝細胞 中國科學院細胞庫；胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培養液 Gibco公司；細胞周期檢測試劑盒 凱基生物技術股份有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒、Caspase-3活性測試盒南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-8 Elisa檢測試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司；COX-2、iNOS、IL-6一抗、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗、組化試劑盒DAB顯色劑 武漢賽維爾生物科技有限公司。

Scientz-ND真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技有限公司；RCO3000T-5-VBC 二氧化碳培養箱美國REVCO公司；722N可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；ELx800全自動酶標儀 美國Bio-Tek基因有限公司；FACSCalibur流式細胞儀美國Becton Dickinson公司；BX53倒置熒光顯微鏡日本Olympus公司；GT1001組化筆 美國Genentech公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 地參游離酚的制備 參照黃菊華等[23]的方法，并略加修改。地參粉末（地參經清洗、真空冷凍干燥、粉碎過60目篩，得到地參粉末）和80%的甲醇溶液以料液比1:20（g:mL）的比例充分混勻，在室溫條件下，利用100 Hz超聲波對混合溶液進行輔助提取，3次（每次10 min）后合并濾液，35 ℃減壓濃縮去除甲醇，剩余液體加入適量6 mol/L的鹽酸調節pH為1～2，并利用乙酸乙酯萃取，5次后合并對應的乙酸乙酯相，并在35 ℃下，減壓濃縮，除去乙酸乙酯，剩余濃縮液用蒸餾水定容至15 mL，即得地參游離酚粗提物。稱取一定量預處理后的X-5大孔樹脂，將其加入到地參游離酚粗提物中，35 ℃水浴振蕩24 h后抽濾，將樹脂置于70%的乙醇溶液中水浴振蕩24 h進行解析，過濾，將濾液35 ℃旋轉蒸發除去乙醇，剩余濃縮液真空冷凍干燥24 h，得地參游離酚提取物純品（得率為1.79%）。使用杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS，2.67 mmol/L KCl，1.47 mmol/L KH2PO4，137.93 mmol/L NaCl，8.06 mmol/L Na2HPO4，pH為7.4±0.1）使其充分溶解，配制成濃度為5 mg/mL的溶液，臨用前用完全培養液（DMEM高糖培養液+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液）稀釋成各個濃度的應用液。

1.2.2 實驗設計 實驗分為正常對照組、地參游離酚干預組及模型組。取對數期的BRL大鼠肝細胞以5×104個/mL接種到6孔板中，每孔2 mL，37 ℃5% CO2培養48 h后，地參游離酚干預組分別加入2 mL不同濃度（0.4、0.8、1.6 mg/mL）的地參游離酚，并為正常組和模型組提供2 mL的完全培養液，培養4 h。隨后，正常組加入800 μL完全培養液，地參游離酚干預組和模型組加入800 μL 100 mmol/L的CCl4溶液，繼續培養3 h。

1.2.3 細胞凋亡的檢測 按照Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒說明書進行操作，細胞按1.2.2方法處理后，4 ℃ 1100 r/min離心5 min，去上清，加入結合液500 μL，輕微重懸細胞，隨后加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，輕輕搖晃，充分混勻，在25 ℃下避光反應10 min，并采用流式細胞儀（Annexin V和PI雙染法）檢測溶液中細胞凋亡情況。

1.2.4 細胞周期分布的檢測 按1.2.2方法處理細胞后，4 ℃ 1100 r/min離心5 min，去上清，用500 μL 70%的冰乙醇固定。D-PBS洗去固定液，4 ℃1100 r/min離心5 min，去上清，加入PI/RNase A染色工作液500 μL，室溫下避光反應60 min，采用流式細胞儀分析細胞周期的變化。

1.2.5 炎癥因子的測定 按1.2.2方法處理細胞后，收集各實驗組細胞培養上清液，4 ℃ 3000 r/min離心20 min，BRL大鼠肝細胞培養上清液中TNF-α、IL-8含量分別按TNF-α、IL-8 Elisa檢測試劑盒說明書進行測定。TNF-α、IL-8標準曲線的回歸方程分別為y=0.0042x+0.0439（R2=0.9912，0～320 pg/mL）和y=0.0069x+0.0014（R2=0.9992，0～240 pg/mL）。

1.2.6 Caspase-3活化程度的測定 按1.2.2方法處理細胞后，各孔均加入0.5 mL的1% Triton X-100裂解細胞，充分吹打混勻，無菌離心管收集培養液，4 ℃ 1100 r/min離心5 min，取上清液。BRL大鼠肝細胞Caspase-3活化程度按Caspase-3活性測試盒說明書進行測定。

1.2.7 蛋白表達水平檢測 將處理好的蓋玻片（24×24 mm）放入6孔板中制備細胞爬片，然后按1.2.2方法處理細胞后，吸走上清液，使用通用組織固定液固定15～20 min，吸走固定液，用D-PBS清洗1～2次。使用免疫組化方法檢測相關因子蛋白表達水平，具體步驟有：細胞破膜、血清封閉、加COX-2/iNOS/IL-6一抗、加HRP標記的山羊抗兔IgG二抗、DAB顯色、復染細胞核、脫水封片，最后在顯微鏡下觀察并拍照（400×），并使用Image-Pro Plus 6.0軟件讀取積分光密度值定量分析蛋白表達情況。陽性表達結果為：若細胞質呈棕黃色至深棕黃色定義為陽性，若只有細胞核著色，細胞質不著色或細胞核、細胞質均不著色定義為陰性[24]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 地參游離酚對CCl4所致BRL大鼠肝細胞損傷細胞凋亡的影響

圖1中左上象限代表壞死細胞，左下象限代表正常細胞，右上象限代表晚期凋亡細胞，右下象限代表早期凋亡細胞。與正常組（圖1a）相比，CCl4模型組中凋亡細胞明顯增多，正常細胞明顯減少（圖1b）；經不同濃度的地參游離酚干預后，凋亡細胞不斷減少，正常細胞逐漸增多（圖1c、d、e）。定量分析結果顯示（圖2），與正常組相比，CCl4模型組的正常細胞減少85.67%（P＜0.05），早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞分別增加32.92%和47.77%（P＜0.05），表明CCl4可誘導細胞凋亡，導致肝細胞壞死。與CCl4模型組相比，0.4、0.8、1.6 mg/mL的地參游離酚干預組正常細胞分別增加27.16%、41.43%和68.00%（P＜0.05），早期凋亡細胞分別減少33.53%、37.89%、32.06%（P＜0.05），晚期凋亡細胞分別減少39.31%、36.16%、39.01%（P＜0.05），表明地參游離酚在一定程度上可以降低細胞凋亡率，抑制肝細胞壞死，從而發揮保護作用，這與喻銘佳[25]的研究結果一致。

圖1 地參游離酚對CCl4所致BRL大鼠肝細胞損傷細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell apoptosis of BRL hepatocyte injured by CC14

圖2 地參游離酚對CCl4所致BRL大鼠肝細胞損傷細胞凋亡影響的定量分析Fig.2 Quantitative analysis of the effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell apoptosis of BRL hepatocyte injured by CC14

2.2 地參游離酚對CCl4所致BRL大鼠肝細胞損傷細胞周期分布的影響

圖3中最高峰為G1期，最高峰前出現的小峰為sub-G1期（細胞凋亡峰），最高峰后面依次為S期和G2期。與正常組（圖3a）相比，CCl4模型組出現明顯的細胞凋亡峰（圖3b）；經不同濃度的地參游離酚干預后，細胞凋亡峰逐漸降低（圖3c、d、e）。由圖4可以看出，相較于正常組而言，CCl4模型組中，處于sub-G1期的BRL大鼠肝細胞的比例顯著升高（P＜0.05），而處于G0/G1、G2/M期的肝細胞比例顯著降低（P＜0.05）。這一實驗結果說明CCl4可將BRL大鼠肝細胞大部分阻滯于sub-G1期，起到誘導細胞凋亡的作用，此結果與WU等[26]的研究結果一致。與模型組相比，0.4、0.8、1.6 mg/mL的地參游離酚預處理后，BRL大鼠肝細胞的凋亡程度明顯降低，且隨著濃度的增加，處于sub-G1期的細胞比例逐漸下降（P＜0.05），G0/G1、G2/M期的比例不同程度升高（P＜0.05）。劉靜、步犁[27-28]的研究表明，當DNA分子受損時，細胞周期會停滯在G0/G1期以便讓DNA進行修復，若修復成功則進行正常分裂增殖。本研究結果表明地參游離酚能抑制細胞凋亡，使細胞阻滯在G0/G1期并能正常修復，從而發揮保護肝細胞損傷的作用。

圖3 地參游離酚對CCl4所致BRL大鼠肝細胞損傷細胞周期的影響Fig.3 Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell cycle of BRL hepatocyte injured by CC14

圖4 地參游離酚對CCl4所致BRL大鼠肝細胞損傷細胞周期分布影響的定量分析Fig.4 Quantitative analysis of the effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell cycle of BRL hepatocyte injured by CC14

2.3 地參游離酚對CCl4所致BRL大鼠肝細胞損傷TNF-α、IL-8和Caspase-3的影響

TNF-α主要由活化的單核細胞或巨噬細胞產生，其在機體中存在的水平高低與機體對應的炎癥嚴重程度呈現出正相關的趨勢，并作為體內重要的炎性因子之一，在肝損傷中發揮重要作用[29-30]。IL-8是機體內重要的中性粒細胞趨化因子，其通過激活中性粒細胞，促進胞內溶酶體活化和吞噬，進而引起局部炎癥反應[31-32]。綜上所述，TNF-α、IL-8兩種細胞因子在體內的水平高低，可作為監測指標，較敏感地反映出體內肝臟的損傷程度。

由表1可知，與正常組相比，CCl4模型組肝細胞中TNF-α和IL-8的含量均顯著升高（P＜0.05），表明CCl4所致肝細胞損傷產生了大量的活性氧自由基，破壞了肝細胞內氧化還原的穩態，從而使肝細胞發生炎癥反應，產生了大量炎癥介質[33-34]。與模型組相比，經地參游離酚處理的大鼠肝細胞中TNF-α和IL-8的含量均有不同程度的降低（P＜0.05），表明地參游離酚能夠在一定程度上抑制促炎因子的表達，減輕肝損傷的炎癥反應。

表1 地參游離酚對CCl4所致BRL大鼠肝細胞損傷TNF-α、IL-8和Caspase-3的影響Table 1 Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on TNF-α、IL-8 and Caspase-3 of BRL hepatocyte injured by CC14

Caspase-3是Caspase家族的核心酵素（一類天冬氨酸或半胱氨酸蛋白酶），被稱為“死亡蛋白酶”。在細胞降解過程中，Caspase-3活化后，對應的細胞質、細胞核及細胞骨架的重要蛋白質會呈現出降解失活的狀態，從而導致細胞凋亡[35]。因此，Caspase-3的活化程度可以從側面反映出細胞的凋亡水平。

由表1可知，與正常組相比，CCl4模型組肝細胞中Caspase-3活化程度增加了44.95%（P＜0.05），表明CCl4作用于肝細胞后，通過脂質過氧化等途徑激活了Caspase-3，使其在肝細胞中廣泛表達，從而導致肝細胞凋亡[36-37]。與模型組相比，0.4、0.8、1.6 mg/mL地參游離酚組Caspase-3活化程度分別減少了17.03%、19.69%和16.37%（P＜0.05）。表明地參游離酚可降低Caspase-3的活化程度，抑制凋亡級聯反應。

2.4 地參游離酚對CCl4所致BRL大鼠肝細胞損傷COX-2、iNOS和IL-6蛋白表達水平的影響

由圖5可以看出，正常組細胞質呈淺藍色，而模型組細胞質呈淺棕或棕褐色，表明CCl4誘導損傷的肝細胞中COX-2、iNOS、IL-6蛋白表達不同程度的增加。與模型組相比，隨著地參游離酚處理濃度的升高，細胞質陽性染色深度逐漸下降，表明細胞中的COX-2、iNOS、IL-6蛋白含量隨地參游離酚濃度的升高而逐漸降低。定量分析結果（圖6）進一步表明，與正常組相比，CCl4模型組肝細胞中COX-2、iNOS、IL-6蛋白表達顯著增高（P＜0.05）。與模型組相比，地參游離酚不同劑量干預組均能夠不同程度降低細胞中由CCl4所致的COX-2、iNOS蛋白表達的升高（P＜0.05）；0.8和1.6 mg/mL地參游離酚干預組能顯著降低IL-6蛋白的表達（P＜0.05）。總體而言，研究結果表明，機體發生炎癥反應或氧化應激時，促炎性酶COX-2，iNOS及致炎性因子IL-6等的表達顯著升高。地參游離酚預處理后，肝細胞中COX-2、iNOS、IL-6蛋白表達不同程度降低，表明地參游離酚可抑制炎癥反應，發揮對CCl4所致肝細胞損傷的保護作用。

圖5 地參游離酚對BRL大鼠肝細胞損傷COX-2、iNOS、IL-6表達水平的影響（400×）Fig.5 Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on expression levels of COX-2, iNOS and IL-6 of BRL hepatocyte injured by CC14（400×）

圖6 COX-2、iNOS、IL-6表達水平的定量分析結果Fig.6 Quantitative analysis results of COX-2, iNOS and IL-6

3 結論

地參游離酚能顯著降低CCl4引起的細胞凋亡，通過減少sub-G1期細胞、增加G0/G1期、G2/M期細胞影響細胞周期的分布，并顯著降低炎癥因子TNFα、IL-8的含量及阻滯Caspase-3的活化程度，且不同程度降低COX-2、iNOS和IL-6蛋白的表達水平，從而發揮肝細胞損傷的保護作用。其機制可能與炎癥信號轉導有關，今后可深入揭示地參游離酚對肝損傷保護作用的抗炎分子機制。研究結果初步表明，地參游離酚可用于肝臟炎性疾病的預防，可為天然抗炎護肝藥物的研發和臨床應用提供借鑒，同時為地參的開發和利用開拓了新的方向。