不同貯藏條件對發芽蒸谷米品質的影響

王翠玲，戴常軍，劉 晴，王 晶，張俐俐，董曉慧，史冬梅,

（1.黑龍江省農業科學院，農產品質量安全研究所，黑龍江哈爾濱 150000；2.黑龍江省農業科學院綏化分院，黑龍江綏化 152000；3.黑龍江省農業科學院，黑龍江哈爾濱 150000）

發芽蒸谷米（germinated parboiled rice，GPR）是稻米經發芽、蒸煮和干燥等處理后生產的大米制品。發芽蒸谷米由于其營養價值高于普通白米和糙米而廣受歡迎[1]。發芽蒸谷米是集發芽糙米與蒸谷米的優點于一體的新型大米類制品，既提高了樣品中總酚含量和抗氧化活性，還合成了大量的γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）。GABA具有多種生理功能，如降低血壓、抑制癌細胞、加速大腦的新陳代謝等[2-3]。發芽蒸谷米會使稻米的內源酶被激活、淀粉糊化和酶失活，使其營養組成和感官品質都得以改善，并可通過控制其含水量延長樣品的保質期[4-5]。

黑稻米是一種富含花色苷、β-胡蘿卜素和多酚類等生物活性物質的有色稻米，屬于水稻中的特殊品種。大量研究表明，如花色苷等生物活性物質有助于改善血脂水平、抗炎、降低氧化應激和預防糖尿病等[6-7]。黑稻米中花色苷的含量和抗氧化活性普遍高于白色稻米。目前，以黑稻米為原料制備的發芽蒸谷米的研究并未有相關報道。而以普通稻米制備的商業化GPR保質期很短（一般在3個月左右），這主要是由于包裝中的含氧量影響脂質水解和氧化反應，從而導致產品的酸敗加劇。已報道的針對蒸谷米儲藏溫度的研究也只是基于（30±2）℃進行，并無低溫貯藏的相關研究[8]。因此，本研究首次基于不同貯藏條件（包裝材料、氧氣和貯藏溫度）對儲藏6個月期間內GPR的品質和生物活性化合物的含量進行研究與分析。能夠對未來發芽蒸谷黑米的商業化生產、貯藏條件的選擇以及保質期的延長提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試黑稻米品種（綏098038；2019年產；黑龍江綏化） 黑龍江省農業科學院提供；γ-氨基丁酸、硼酸鹽緩沖液、2-羥基-1-萘甲醛、2,2-二苯基-1-吡啶并肼基（≥98%） 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；實驗所需化學試劑為色譜級（其中，酸類試劑為電子（MOS）級） 天津市科密歐化學試劑有限公司；RBiopharm黃曲霉毒素總量酶聯免疫檢測試劑盒 德國拜發公司；鋁層壓聚乙烯（aluminum-laminated polyethylene，ALPE）、聚酰胺-聚乙烯（polyamidepolyethylene，PAPE） 誠德科技股份有限公司。

GL-21M高速冷凍離心機 上海市離心機機械研究廠；Daogrs S8xs型電蒸箱 意大利聯合電器集團公司；DGG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗設備有限公司；WJ-HW-80L小型精密實驗室烘箱恒溫鼓風烘干機 杭州五佳機械設備有限公司；FC-2K小型礱谷機 日本YAMAMOTO有限公司；Multivac C-400真空包裝機 莫迪維克（上海）貿易有限公司；STRIKE 300旋轉蒸發儀 優萊博技術（北京）有限公司；A2-SET-HP通風濕度計 羅卓尼克（廣州）有限公司；Millipore-Q密理博超純水儀美國密理博（中國）有限公司；Synergi 4μm Hydro-RP 80 A色譜柱（150 mm×4.6 mm） 美國Phenomenex有限公司；Evolution 350紫外可見分光光度計 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發芽蒸谷米的制備 以黑稻米為原材料，其含水率（w.b.）約為11%。然后將其保持在（23±1）℃，相對濕度（RH）為（52%±2%）的條件下備用。制備發芽蒸谷米時，將黑稻米（500 g）放置于35 ℃的水（1.5 L）中浸泡24 h，洗滌、瀝干后在35 ℃的氣候室（RH為90%）中孵育16 h[9]。發芽后，可觀察到一個小胚根，長約0.5～1 mm。將發芽的黑稻米在電蒸箱中蒸煮30 min，最后用烘干機在50 ℃，含濕量為25 g/kg干空氣，風速為1.0 m/s的條件下烘干3 h，最終獲得水分含量為12%～14%的GPR。

1.2.2 發芽蒸谷米的貯藏 將100 g GPR樣品放置在由兩種材料制成的15 cm×18 cm包裝袋中：鋁層壓聚乙烯（ALPE）：厚度為117 μm，水蒸氣滲透性為6.45×10-8kg/（m2·d·Pa），氧氣透過率為0.0215 L/（m2·d）；聚酰胺-聚乙烯（PAPE）：厚度為90 μm，水蒸氣滲透性為2.25×10-7kg/（m2·d·Pa），氧氣透過率為0.12 L/（m2·d）。將樣品袋在大氣壓（≈ 900 mbar）和低壓（下文統稱真空（60 mbar））條件下用Multivac C-400真空包裝機進行熱封。然后，將包裝樣品分別放置在冰箱（溫度（4±2）℃，RH為（55%±5%））和貯藏室（溫度（30±2）℃，RH為（35%±5%））。貯藏室模擬目前的非冷藏儲存，由于近些年全球氣溫普遍升高，多數情況下的常溫貯存達不到理想狀態的20～25 ℃，最終確定以30 ℃為本研究的貯藏溫度[10]。表1中列出了基于現有文獻資料[8-10]及相關預實驗所確定的待測實驗樣品編碼及其涉及到的多因素實驗條件的組合情況，每月從不同貯藏條件分別隨機抽取3份樣品進行品質分析（n=3），貯藏期為6個月。

表1 實驗因素組合及樣品編碼Table 1 Combination of experimental factors and the sample code

1.2.3 水分含量和活度的測定 水分含量（moisture content，MC）采用直接干燥法進行測定[11]。在密閉、恒溫的水分活度儀測量艙內，試樣中水分擴散平衡，此時水分活度儀測量艙內的傳感器或數字化探頭顯示出的響應值（相對濕度對應的數值）即為樣品的水分活度（water activity，Aw）[12]。

1.2.4 生物活性物質的測定

1.2.4.1γ-氨基丁酸（GABA）含量的測定 基于KHUHAWAR等[13]的提取方法進行了改進，將20 mL的80%（體積比）甲醇加入到1.2 g的GPR中，隨后勻漿3 min。將混合物在4 ℃下以5000 r/min離心10 min，隨后通過濾紙進行過濾，重復上述步驟2次，使用旋轉蒸發儀在50 ℃下蒸發合并萃取液。將提取物重新溶解在5 mL超純水中，并放置在-22 ℃條件下備用。將1 mL待測樣品添加到0.6 mL硼酸鹽緩沖液（pH8）中并滴加1 mL的2-羥基-1-萘醛衍生試劑（質量體積比0.75%）。將混合物置于80 ℃水浴中加熱10 min，最終用甲醇定容至5 mL。GABA檢測是基于HAYAT等[14]的方法改進后通過HPLC進行測定。將20 μL樣品注入色譜柱中。通過使用流動相A（甲醇100%）和流動相B（H2O）以1 mL/min的流速洗脫樣品。梯度洗脫程序從0 min時使用50%流動相A開始，然后在1 min時增加到60%，在4 min時增加到70%，在7 min時增加到80%，在9 min時增加到90%，然后在11 min時減少到50%，直到18 min運行結束。檢測波長為254 nm、柱溫30 ℃。檢測結果以mg GABA/100 g GPR（以干基計）表示。

1.2.4.2 總 花 色 苷 含 量（Total anthocyanin content，TAC）的測定 將1 g的GPR樣品加入到20 mL酸化的甲醇（40%甲醇:濃鹽酸=98:2，體積比）中，均質化10 min后以180 r/min振蕩1 h。將樣品在4 ℃下以5000 r/min離心10 min，留取上清液部分利用酸化后的甲醇定容至25 mL，保存在-22 ℃備用。基于SUTHARUT等[15]所述改良的pH示差法來測定提取物中總花色苷的含量。使用分光光度計在pH為1.0和4.5的緩沖液中分別測定樣品在510 nm和700 nm的吸光度。TAC以mg 矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside equivalents，CGE）/100 g GPR（干基）表示。

1.2.4.3 總酚含量（Total phenolic content，TPC）的測定 取1 g的GPR用3 mL的80%（體積比）甲醇進行兩次萃取，每次萃取時將離心管中的混合物置于60 ℃水浴中，并在孵育過程中渦旋兩次。隨后，以10000 r/min離心10 min，合并上清液并用80%甲醇定容至10 mL，放置于-22 ℃留存備用。基于Folin-Ciocalteu比色法[16]進行TPC分析。避光孵育2 h后使用分光光度計在760 nm處測量吸光度，TPC以mg 沒食子酸當量（Gallic acid equivalents，GAE）/100 g GPR（干基）表示。

1.2.5 抗氧化活性的測定 清除2,2-二苯基-1-吡啶并肼基（DPPH）自由基活性[17]，吸取上述TPC測定時的提取物200 μL，與新鮮制備的DPPH溶液（60 μmol/L的80%甲醇溶液，2.8 mL）混合。在避光環境中孵育30 min后，在517 nm下測得的吸光度，其抗氧化活性表示為：mg Trolox當量（Trolox equivalents，TE）/100 g GPR（干基）。采用鐵離子還原/抗氧化能力法（Ferric reducing antioxidant potential，FRAP）進行總抗氧化性的測定[18]。將混合物避光孵育30 min后，在593 nm處測定吸光度，FRAP以mg TE/100 g GPR（干基）表示。

1.2.6 脂質過氧化的測定 丙二醛（Malondialdehyde，MDA）采用硫代巴比妥酸法（TBARS）進行測定，通過對MOKO等[19]方法稍作調整，將GPR（約50 mg）與正丁醇（25 mL）混合，取出5 mL混合溶液，并加入5 mL的TBA試劑。將該溶液在95 ℃下孵育2 h。使用分光光度計在528 nm處測量吸光度的增加，以mg TBA/g GPR（干基）表示。

1.2.7 酸敗度的感官評價 GPR樣品無需事先浸泡，按1:1.5（質量體積比）的飯水比煮熟。食用前將煮熟的GPR在室溫下于密閉容器中放置30 min。稱取約15 g煮熟的GPR裝在盤子中，以隨機順序提供給小組成員。感官評價來自于經過培訓后的20名工作人員（年齡在24～44歲，10名男性，10名女性）。酸敗評價基于KLAYKRUAYAT等[10]的方法采用線性15 cm刻度（0 cm為不酸敗，15 cm為強烈酸敗氣味）。要求小組成員比較在不同條件下儲存6個月前后GPR的酸敗情況。此外，小組成員可要求選擇接受或拒絕樣品。

1.2.8 微生物指標的測定 依據GB 4789.2-2016的相關標準內容進行GPR樣品的菌落總數的測定[20]；依據GB 4789.15-2016對GPR樣品的霉菌和酵母菌進行測定[21]；通過黃曲霉毒素總量（AFT）酶聯免疫檢測試劑盒對GPR的黃曲霉毒素總量進行測定。依據相關標準和試劑盒說明書所述進行具體操作步驟。

1.3 數據處理

本研究的檢測結果表示為3次重復樣品的平均值±標準偏差。方差分析（單向方差分析），在95%置信水平下，用Duncan多重范圍檢驗確定均值之間的差異，檢測結果分析時：顯著性差異（P＜0.05）用不同的小寫字母表示，無顯著性差異（P＞0.05）用ns表示。感官評價是在完全隨機區組設計（randomized complete blocks design，RCBD）中進行的。使用SPSS和Origin等軟件進行相關數據的統計分析。

2 結果與分析

2.1 貯藏條件對水分含量和水分活度的影響

如表2所示，與30 ℃的儲存相比較，在4 ℃相對濕度為55% 的貯藏條件下，GPR樣品的MC（11.51%～12.25%）和Aw（0.56～0.62）在6個月的貯藏期內變化較小。兩種包裝材料在常壓和真空條件下無破損現象，均可正常使用。在30 ℃時，在常壓和真空條件下PAPE 30A和PAPE 30V包裝中GPR樣品的MC和Aw值在6個月內有明顯的下降，分別為8.19%和9.43%，0.27和0.33。但是，在ALPE包裝中的GPR樣品則基本保持不變。實驗結果說明在30 ℃的儲存條件下，ALPE可以有效阻止GPR的水分流失。

表2 貯藏期內GPR的水分含量和水分活度的變化Table 2 Changes in moisture content and water activity of GPR during storage

2.2 貯藏條件對生物活性物質的影響

目前，對于GPR中γ-氨基丁酸（GABA）的研究發現其含量一般為（19.22±0.03）mg/100 g[14]。如圖1所示，不同包裝材料與氧氣含量對GABA含量幾乎無影響。GABA含量主要受貯藏時間與溫度的影響，隨貯藏時間及溫度的增加而降低。在30 ℃的儲存期內，GABA含量在1個月后顯著下降至（14.25±0.29）～（16.32±0.38）mg/100 g（P＜0.05），然而該值在2個月后基本保持不變。在儲存6個月后，在4 ℃條件下GPR保留的GABA含量仍維持在（16.82±0.81）～（17.43±0.42）mg/100 g。此結果表明低溫儲存可以有效抑制GABA的減少。另一方面，在相同溫度下儲存在不同包裝袋中的GPR的GABA含量差異不顯著（P＞0.05）。在儲存過程中影響GABA含量的儲存條件的相關研究較少。PARNSAKHORN等[22]已報道在4 ℃和37 ℃條件下貯存8個月后發芽糙米中GABA含量的下降幅度分別為30.90%和28.70%，兩者均無顯著性差異（P＞0.05）。然而，本研究發現，在4 ℃儲存后GABA含量僅下降了9.65%～11.58%，且在6個月貯藏期后高于30 ℃時的含量（30.52%～33.24%）。發芽蒸谷米GPR的胚乳在淀粉糊化過程中變硬，所以在貯藏過程中更耐破壞。在較高溫度條件下GABA的降解機理可能是由于水分子的流失和γ-丁內酰胺的形成而引起的結構分解[23]。然而，GPR的低溫儲存導致GABA含量的增加，這可能是由于GABA作為一種防御機制在應對冷脅迫時的積累作用[10]。因此，在4 ℃下儲存的GPR中GABA含量在儲存過程中略有波動。因為GABA含量受儲存溫度的影響，GPR應在低溫下儲存以保存其GABA的含量。

圖1 貯藏條件對GABA含量的影響Fig.1 The effects of storage conditions on GABA content

有色稻米中花色苷種類主要包括矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷。在本研究的黑稻米中GPR的總花色苷含量（TAC）約為5.68 mg CGE/100 g。TAC的變化情況如圖2所示，在4 ℃條件下貯藏2個月后，GPR樣品中的TAC含量無顯著性變化（P＞0.05），而在30 ℃條件下變化顯著（P＜0.05），TAC含量降低較快，這是由于花色苷在較高溫度下易降解。將GPR儲存在4 ℃時可有效減少總花色苷的損失。由于花色苷具有抗氧化特性，因此花色苷在30 ℃條件下貯藏3個月后發生降解可能是由于花色苷與脂質氧化自由基的反應[24]。這些現象都與氧化產物的形成有關，氧化產物在3個月后迅速增加，6個月后，貯藏在30 ℃處的GPR中TAC約為儲存在4 ℃時TAC的一半。而不同包裝材料和含氧量對TAC含量并無影響。

圖2 貯藏條件對TAC的影響Fig.2 The effects of storage conditions on TAC

如圖3所示，GPR的初始總酚含量（TPC）為（105.08±3.11）mg GAE/100 g。6個月后，在4 ℃貯藏條件下所有包裝中的GPR的TPC為（69.03±1.68）～（97.85±1.64）mg GAE/100 g，均高于在30 ℃時相同變量貯藏條件下TPC的含量，4 ℃的真空ALPE包裝中TPC含量最高。據SRIPUM等[5]相關研究證明有色稻米和發芽糙米中的TPC在6個月后均會下降。氧氣和儲存時間對黑稻米TPC的影響較大，光照、溫度、氧含量、pH和貯藏時間等因素都會影響稻米中酚類化合物的穩定性[25-26]。如圖3可知，在其它條件不變的情況下，貯藏6個月后，真空狀態下TPC含量明顯高于正常大氣壓下TPC含量。較低的氧氣傳輸速率可以保護酚類化合物。

圖3 貯藏條件對TPC的影響Fig.3 The effects of storage conditions on TPC

2.3 貯藏條件對抗氧化活性的影響

GPR的抗氧化能力可能來自多種成分，包括酚酸、類黃酮、花色苷、原花青素、生育酚、γ-異黃醇和植酸等物質。由DPPH自由基清除活性和鐵還原/抗氧化電位（FRAP）確定GPR在貯藏過程中抗氧化能力的變化如圖4（A）、（B）所示。抗氧化能力均隨貯藏時間的延長而降低。在貯藏6個月后，4 ℃下GPR的DPPH和FRAP值明顯高于在30 ℃下儲存的值。DPPH自由基清除能力并未受到包裝材料與含氧量的影響。而FRAP含量卻受到含氧量的影響較大，由圖4（B）可知，貯藏6個月后真空狀態下的FRAP值比正常大氣壓下的含量高。而抗氧化能力的喪失程度可能與脂質氧化直接相關，這是在高溫下暴露于氧氣中儲存的結果[5,27]。在真空中儲存比正常氣壓下更能保持GPR的抗氧化能力。

圖4 貯藏條件對抗氧化活性的影響Fig.4 The effects of storage conditions on antioxidant activity

2.4 貯藏條件對脂質過氧化的影響

GPR含有大量的脂質，尤其是在麩皮外層，所以極易發生脂質自氧化反應。本研究采用硫代巴比妥酸（TBA）法監測脂質氧化的變化。在528 nm處吸光度的增加可用于表示脂質氧化的二次產物丙二醛（MDA）。由圖5可知，TBA值在初始階段緩慢升高，而在3個月貯藏期后迅速升高。一般情況下，發芽蒸煮糙米的TBA值在30 ℃下存儲3個月后顯著增加，而用ALPE包裝的蒸煮米TBA值增速比其他包裝材料低[28]。由于高溫和富氧條件加速了脂質氧化的速率，在真空條件下貯藏時TBA值明顯下降。吸光度隨著貯藏時間而增加可能與包裝材料的透氧性有關[8]。結果表明，使用ALPE包裝的GPR具有較低的吸光度。此外，在4 ℃下儲存的TBA值（（2.41±0.16）～（5.23±0.25）mg/g）在6個月后低于30 ℃的TBA值（（6.74±0.15）～（9.13±0.28）mg/g）。

圖5 貯藏條件對脂質過氧化的影響Fig.5 The effects of storage conditions on lipid peroxidation

2.5 酸敗度的感官評價

由20名小組成員評估的酸敗度分數與硫代巴比妥酸法測定結果高度相關（R2=0.9943），如圖6（A）所示。由圖6（B）可知所有條件下的酸敗評分均較初始值顯著提高（P＜0.05），說明貯藏溫度、氧氣濃度和包裝材質都會對酸敗的評分產生影響。所有GPR樣品在貯藏6個月后酸敗評分依然較低，并且所有樣品都在小組成員的可接受范圍內。儲存在真空ALPE中的GPR的酸敗評分最低，可能是因為這種包裝材料可以很好地保護GPR免受氧氣的影響。

圖6 酸敗度的感官評價Fig.6 Sensory evaluation of rancidity

2.6 微生物特性

由表3可知，在貯藏期間，菌落總數呈逐漸增加的趨勢，但均未超過104CFU/g，而在整個儲存期間內未檢測到酵母菌和霉菌。目前，國內并沒有現行有效的蒸谷米相關的微生物限量標準，而歐盟及其它國家標準規定蒸谷米的微生物限量為菌落總數不得高于106CFU/g，酵母菌和霉菌計數不得高于500 CFU/g[29-30]。在30 ℃下貯藏的GRP樣品菌落總數高于4 ℃，貯藏溫度顯著影響了微生物的生長（P＜0.05）。此外，貯藏在真空包裝中GPR的細菌數明顯低于常壓包裝。隨著貯藏時間的延長，黃曲霉毒素含量顯著增加（P＜0.05）。相同的貯藏期內，在30 ℃處的黃曲霉毒素含量高于4 ℃處的含量。貯藏6個月后，在30 ℃時儲存在真空PAPE和真空ALPE包裝中的GPR分別含有（2.83±0.07）μg/kg和（2.65±0.36）μg/kg的黃曲霉毒素，顯著低于PAPE（4.52±0.36）μg/kg。所有GPR樣品的黃曲霉毒素總量并未超過國家標準規定的限量值10 μg/kg[31]。表明本研究過程中待測樣品的微生物指標符合相關要求，可放心食用。

表3 不同條件下貯藏6個月的GPR的微生物指標Table 3 Microbiological indicators of GPR stored for 6 months under different conditions

3 結論

本研究分析了在6個月貯藏期間內，貯藏條件（溫度、包裝材料和氧氣）對GPR的理化性質、生物活性化合物、抗氧化活性、感官評價和微生物特性的影響。結果表明：包裝材料ALPE比PAPE的密閉性更好，更有助于發芽蒸谷米的貯藏，延緩酸敗。GPR的水分含量和水分活度在4 ℃和真空ALPE下貯藏期間保持不變。生物活性化合物，包括總花色苷含量、總酚含量、抗氧化活性和GABA含量隨貯藏溫度和時間的增加而降低，將GPR儲存在4 ℃的真空ALPE中是保存其生物活性化合物的最適貯藏條件。盡管隨著貯藏時間的延長酸敗程度略有增加（特別是在30 ℃時），但該產品的酸敗仍然在可接受范圍內。此外，在6個月貯藏期后，GPR中的微生物數量和黃曲霉毒素含量均小于國家相關標準的規定，說明實驗過程中GPR樣品的微生物指標符合標準要求并可放心食用。本研究能夠對未來發芽蒸谷黑米的商業化生產，貯藏條件的選擇以及保質期的延長提供一定的理論基礎。