響應面法優化薄荷、丁香和殼聚糖復配對鮮切蘋果的保鮮效果

吳永玲，朱昱靜，宋 爽，吳延寧，胡世麒

（1.商洛學院生物醫藥與食品工程學院，陜西商洛 726000；2.商洛市農產品質量安全中心，陜西商洛 726000）

鮮切蘋果，含有糖類、維生素C等多種成分，同時具有新鮮、即食、方便、營養等特點，深受國內外廣大消費者的喜愛[1]。但鮮切蘋果在加工過程中的機械處理導致蘋果表面容易發生褐變、微生物污染及營養損失等問題，嚴重影響其品質和產業發展[2-3]。特別是鮮切蘋果在加工和包裝中的高濕度條件和大片切割表面為一些真菌的繁殖提供了豐富的營養物質，增加了被病原微生物感染的敏感性[4-5]，其中，蘋果腐爛病菌（Cytosporasp.）是制約我國蘋果產業發展的主要因素之一，主要危害結果枝干和果實，若處理不當，發生在果實上會導致果肉組織松軟、有酒糟味，使得產品口感下降和貨架期縮短[6-8]。

目前常用的保鮮方法是添加化學護色劑或抗氧化劑，如美國食品藥物管理局允許使用0.5～1.2 g/L的亞氯酸鈉對果蔬和鮮切果蔬進行噴灑或浸泡等[9]，但這會帶來一定的食品安全問題[10-12]。近年來人們的健康環保意識日漸增強，化學處理保鮮劑的安全性始終備受質疑，具有安全、低毒、低殘留的天然源保鮮物質逐漸成為研究熱點[13-16]。薄荷和丁香提取物具有天然源保鮮物質的優點，即無任何化學殘留和毒副作用，具有廣譜、高效的抑菌作用[17-19]，符合人們對食品保鮮劑綠色、環保的要求，同時，殼聚糖因具有無毒、無污染、可再生及較好的生物相容性和降解性，被廣泛應用為果蔬保鮮劑[20-21]。

本文以薄荷、丁香和殼聚糖為研究材料，以對蘋果腐爛病菌的抑制率為評價指標，采用單因素結合響應面試驗確定其最佳復配比例，并制備最佳復配保鮮劑，從硬度、失重率、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、菌落總數及感官評定等方面考察其對鮮切蘋果的保鮮效果，以進一步拓寬薄荷、丁香的資源開發，為鮮切水果的保鮮提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薄荷、丁香 購自商洛市中藥店，實驗前烘干至恒質量后粉碎，裝于密封袋中備用；“紅富士”蘋果八成熟，購自商洛市永輝超市；蘋果腐爛病菌（Cytosporasp.），即子囊菌亞門蘋果黑腐皮殼菌 西北農林科技大學無公害農藥研究中心；殼聚糖、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、無水乙醇、氫氧化鈉、草酸、鄰苯二甲酸氫鉀、2,6-二氯酚靛酚、氯化鋇、醋酸、鹽酸、酚酞指示劑等 均為分析純，上海阿拉丁試劑公司。

LQ-C5001電子天平 常州奧豪斯儀器有限公司；SHB-IIIA循環水式真空泵 合肥晶耀真空有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗器昆山超聲儀器有限公司；TG16-WS型高速離心機長沙凱達儀器有限公司；GY-3型果實硬度計 艾普計量儀器有限公司；LRH-70F生化培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 保鮮劑配比的確定

1.2.1.1 樣品的處理 薄荷、丁香乙醇提取液的制備：分別稱取10 g干燥薄荷、丁香粉碎至60目，過篩，按1:20料液比加入乙醇溶液（80%），置于120 W超聲波清洗器中振蕩30 min（60 ℃），過濾后上清液真空旋轉蒸發至干，剩余物質即為薄荷、丁香提取浸膏。用無菌蒸餾水稀釋浸膏至10 g/L，并用10%（v/v）氫氧化鈉調節溶液pH至中性，設定為母液，4 ℃下保存備用，不同濃度的薄荷、丁香提取液分別用母液按百分比配制而成。

殼聚糖溶液的制備：分別用質量分數為0.5%（m/m）的乙酸溶解后調成中性備用。

1.2.1.2 單因素實驗 通過文獻調研及前期實驗，把2%薄荷提取物、3%丁香提取物、1.5%殼聚糖設定為基礎水平，采取單因素法研究不同濃度薄荷提取物（0%、1%、2%、3%、4%）、丁香提取物（1%、2%、3%、4%、5%）、殼聚糖（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）三個因素對蘋果腐爛病菌的抑制效果。研究其中一個因素的影響時其他因素水平與基礎水平一樣，以對蘋果腐爛病菌的抑制率為指標，研究每個因素對蘋果腐爛病菌抑菌率的影響。

1.2.1.3 響應面試驗 綜合單因素實驗結果，采用Box-Behnken設計試驗，以薄荷提取物、丁香提取物、殼聚糖為三個變量，以對蘋果腐爛病菌的抑制率為響應值進行三因素三水平響應面試驗設計（如表1），利用Design-Expert.V8.0.6軟件分析數據，得出薄荷、丁香、殼聚糖保鮮劑的最佳配方及工藝參數。

表1 Box-Behnken試驗的因素及水平Table 1 Factors and level of Box-Behnken experiment

1.2.2 抑菌活性的測定 含藥平板的制備：根據單因素實驗設計將不同濃度提取物及殼聚糖配制成所需藥液，與配制好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA培養基）混合均勻后倒入培養皿中制成含藥平板[22]。

生長速率法：分別將蘋果腐爛病菌的菌餅接種到含藥培養基的中央（用打孔器制成6 mm的菌餅，用接種針接種），每個濃度重復3次，同時設置清水對照組CK和空白對照組CK1（即對應變量因素含量為0，其他因素水平為基礎水平），置于電熱培養箱中培養72 h（26 ℃），采用十字交叉法測量各供試菌的菌落生長直徑，用公式（1）計算抑菌率，其中，用空白對照作為對照生長直徑。

1.2.3 最佳復配保鮮劑保鮮效果研究

1.2.3.1 果實及處理 選擇表面光潔、無病蟲害、大小和果色均勻、帶果柄且成熟度一致的“紅富士”蘋果，當天將蘋果用清水進行清洗瀝干。

蘋果的處理：清水清洗蘋果后在無菌操作臺下紫外殺菌30 min，將刀具消毒后對蘋果進行去皮、去核、切塊（縱切成1～1.5 cm厚的薄片）[23]。將切好的蘋果放入制備好的保鮮劑中分別浸泡2 min，取出晾干后裝入聚乙烯保鮮袋中，每袋200 g左右，每提取物的處理16袋，同時以無菌水為清水對照（CK）。將上述處理好的樣品置于4 ℃冰箱中儲藏，每隔1 d（即在0、2、4、6、8、10 d）測定相關指標，所有指標重復3次，取平均值。

1.2.3.2 失重率和硬度的測定 失重率的測定采用稱取重量的方法，用公式（2）計算前后的質量差。

硬度的測定參照文獻[24]中的方法，用硬度計測定蘋果赤道部位4個點硬度，每組重復測定3次。

1.2.3.3 抗壞血酸（VC）含量和還原糖含量的測定抗壞血酸含量的測定采用2，6-二氯靛酚滴定法[25]，還原糖含量的測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法[26]。

1.2.3.4 可滴定酸含量和可溶性固形物的測定 以酒石酸計，參照龔迪等[27]的方法采用酸堿滴定法，稱取果肉組織10 g，磨碎，加入煮沸冷卻后除去二氧化碳的蒸餾水，移入250 mL容量瓶中；定容→搖勻→過濾→濾液用移液管吸取10 mL注入錐形瓶→加入1%酚酞指示劑→用NaOH溶液滴定，每組重復3次。

可溶性固形物的測定采用阿貝折光儀測定鮮切蘋果中可溶性固形物含量的變化[28]。

1.2.3.5 褐變度的測定 采用消光值法測定[29]。取樣品與冷卻蒸餾水1:10（g:mL）混合勻漿后于0 ℃、5000 r/min離心20 min，取上清液在410 nm波長下測定吸光值（A410），結果以10×A410表示褐變度。

1.2.3.6 菌落總數的測定 采用食品安全國家標準食品微生物學檢驗中菌落總數的測定方法（GB 4789.2-2016）[30]測定鮮切蘋果表面的菌落總數。

1.2.3.7 感官評定 感官評定隨機抽取10人，按照果蔬感官評定要求，采用多層次綜合評判法對鮮切蘋果的感官質量獨立進行評判。每組重復3次后取平均值，評定指標見表2。

表2 鮮切蘋果感官評分標準Table 2 Sensory scoring standards of fresh-cut apples

1.3 數據處理

采用Excel和SPSS 17.0軟件對3次平行重復檢測實驗數據進行統計學分析，采用Origin 8.0軟件分別作圖；采用LSD進行顯著性差異分析，即P＜0.05為差異顯著、P＜0.01為差異極顯著，數據值以平均值±標準誤差（n=3）表示。

2 結果與分析

2.1 單因素抑菌實驗結果

由圖1可見，低濃度時薄荷提取物、丁香提取物、殼聚糖含量對蘋果腐爛病菌的抑菌效果均隨濃度的增加呈上升趨勢，不同提取物含量之間的抑制率均呈顯著性差異（P＜0.05）。當薄荷提取物含量達到2%時抑菌率為78.3%，當丁香提取物含量達到3%時抑菌率為76.7%，當殼聚糖含量達到1.5%時抑菌率為78.5%，之后隨各變量繼續增加，抑菌率均趨于平緩增長。因此，根據單因素實驗結果結合實際生產的經濟性，選擇薄荷提取物含量為1%～3%；丁香提取物含量為2%～4%；殼聚糖含量為1%～2%進行響應面試驗。

圖1 單因素實驗各變量對蘋果腐爛病菌的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of single factor against Cytospora sp.

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 回歸模型的建立 綜合單因素實驗結果，利用Box-Behnken設計法，選擇Design-ExpertV 8.0.6軟件，以抑制率（Y）與薄荷提取物含量（A）、丁香提取物含量（B）、殼聚糖含量（C）之間建立回歸模型，對表3中響應面試驗結果進行多次回歸擬合，得到回歸方程：Y=94.05+2.89A+1.13B+0.51C-0.69AB+0.29AC+0.64BC-1.86A2-0.46B2-0.65C2

表3 復配保鮮劑響應面試驗設計Table 3 Response surface experimental design of compounding preservative

2.2.2 模型顯著性檢驗及響應面交互作用分析 如表4所示，模型達到極顯著水平，同時方程失擬項P=0.3143，失擬項不顯著，實驗測量值與模型預測值基本一致，R2=0.9570，變異系數CV=0.87，證明模型選擇可靠、預測值與實際值相差不大，故可用此模型分析和預測保鮮劑中影響抑菌率的三個因素的變化規律。此外，由P值可得，在模型模擬范圍內，影響保鮮劑抑菌率的程度大小為：A（薄荷提取物含量）＞B（丁香提取物含量）＞C（殼聚糖含量），其中，薄荷提取物含量和丁香提取物含量對保鮮劑抑菌率的影響極顯著（P＜0.01）。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of the regression model

將模型中A、B和C三因素在方差分析的基礎上固定在中間水平上，以對蘋果腐爛病菌的抑制率作為響應指標，得出其他兩個因素交互作用保鮮劑抑菌率模型，并根據該模型繪制等高線圖與3D圖，得到一個理論最大值。如圖2所示，響應面圖投影面為等高線圖，等高線彎曲程度反應了兩因素之間的交互作用大小[31]，可知薄荷提取物與丁香提取物交互作用對抑菌率的影響較大，同時，二次項A2對試驗結果的影響也極顯著。

圖2 兩因素交互作用影響保鮮劑抑菌率的響應面效果圖Fig.2 Response surface effect of the interaction of two factors affecting the antifungal activity of preservatives

2.2.3 最佳復配條件的確定及驗證 根據薄荷、丁香、殼聚糖復配保鮮劑響應面法試驗結果，可得到在最佳添加量下保鮮劑對蘋果腐爛病菌的抑制率預測值為95.84%，即薄荷提取物、丁香提取物、殼聚糖提取物含量分別為2.15%、2.96%、1.52%。考慮實際可操作性，將最優添加量調整為2%、3%、1.5%，最終抑制率實際值為95.03%（如圖3所示），預測值與實測值差異較小，且穩定性在重復性實驗下證明有一定可靠性，表明此響應面優化法對薄荷丁香保鮮劑配方的確定有參考價值。

圖3 清水對照組和最佳復配處理組對蘋果腐爛病菌的抑制效果圖Fig.3 The antifungal effect of the control group and the best compounding treatment group on Cytospora sp.

2.3 最佳復配保鮮劑對鮮切蘋果的保鮮效果的影響

2.3.1 最佳復配保鮮劑對鮮切蘋果失重率和硬度變化的影響 由圖4可見，鮮切蘋果貯藏期間的失重率逐日呈顯著性增加（P＜0.05），貯藏前期鮮切蘋果呼吸作用較強，組織內部的營養成分消耗較大；在貯藏末期，由于果實的呼吸速率逐漸減慢，營養物質消耗逐漸減少。貯藏2～10 d，清水對照組（CK）處理的鮮切蘋果失重率始終大于處理組（P＜0.05）。這可能與提取物在鮮切果肉表面形成了一層保護膜有關，能有效調節氣體和水分的交換，進一步減少了鮮切蘋果中水分的消耗。

圖4 最佳復配保鮮劑對鮮切蘋果失重率和硬度變化的影響Fig.4 The effect of the best compounding preservative agent on the weight loss rate and hardness change of fresh-cut apples

硬度作為評判鮮切果蔬貨架期的重要指標之一，隨著貯藏時間的延長，組織軟化后會發生刺激反應、老化、腐敗現象。由圖4可看出，所有蘋果的硬度在貯藏期間均有所下降，在貯藏2～10 d間，清水對照組與處理組之間硬度變化呈顯著性差異（P＜0.05）。其中對照組在貯藏第10 d時蘋果硬度變化與第8 d相比無顯著性差異（P＞0.05）。處理組的硬度在貯藏6 d后下降速率開始變得平緩，其中第6 d與第8 d硬度變化無顯著性差異（P＞0.05）。在鮮切蘋果貯藏后期，復配保鮮劑提取物可以阻隔其水分及營養物質的流失，從而減緩其硬度值的降低。

2.3.2 最佳復配保鮮劑對鮮切蘋果抗壞血酸含量和還原糖含量變化的影響 抗壞血酸含量作為鮮切蘋果營養價值的重要組成之一，在蘋果貯藏期內呈現逐漸下降的趨勢。由圖5可知，貯藏0～2 d時抗壞血酸含量下降最快，貯藏2～10 d時抗壞血酸含量下降則趨于平緩，清水對照組在整個貯藏期內抗壞血酸含量均顯著性低于處理組（P＜0.05）。這可能與復配保鮮劑抑制天然還原性物質抗壞血酸氧化速率有關。

還原糖含量是評價鮮切蘋果品質的重要指標之一。如圖5所示，貯藏2～10 d內，對照組還原糖含量下降速率顯著大于處理組（P＜0.05），其中貯藏8 d時清水對照組還原糖含量下降了40%，處理組下降了25%，該結果證實復配保鮮劑在一定程度上有延緩鮮切蘋果還原糖含量降解速率的作用。

圖5 最佳復配保鮮劑對鮮切蘋果抗壞血酸含量和還原糖含量變化的影響Fig.5 The effect of the best compounding preservative agent on ascorbic acid content and reducing sugar content changes of fresh-cut apples

2.3.3 最佳復配保鮮劑對鮮切蘋果可滴定酸含量和可溶性固形物變化的影響 可滴定酸含量也是影響鮮切蘋果口感和貯藏的重要因素之一。由圖6可知，貯藏2～10 d內，處理組可滴定酸含量均顯著大于對照組（P＜0.05）。貯藏前期，清水對照組可滴定酸含量比處理組下降速率快，貯藏6 d后，兩組可滴定酸含量均下降緩慢。進一步說明對照組果實代謝活躍，大部分有機酸首先作為呼吸底物被消耗，而處理組可使果實保持較高的酸含量，降低營養物質的消耗，延長保鮮期。

圖6 最佳復配保鮮劑對鮮切蘋果可滴定酸含量和可溶性固形物變化的影響Fig.6 The effect of the best compounding preservative agent on the titratable acid content and soluble solids changes of fresh-cut apples

可溶性固形物是以碳水化合物為主，果實體細胞液內的多種營養成分及礦物質，是評判果實品質、成熟程度的重要指標。如圖6所示，處理組鮮切蘋果可溶性固形物含量在貯藏期間均呈下降趨勢，第4 d時下降較多，清水對照組下降速率最快。貯藏2～10 d，處理組鮮切蘋果可溶性固形物含量與對照組存在顯著性差異（P＜0.05）。蘋果中可溶性固形物含量的降低是由于呼吸作用不斷消耗糖分使得可溶性固形物含量下降，提取物處理組使得鮮切蘋果可溶性固形物下降較緩慢，可能是由于其中有效成分在一定程度上抑制了蘋果的生理代謝作用，減弱呼吸消耗作用的結果。

2.3.4 最佳復配保鮮劑對鮮切蘋果褐變度的影響褐變是影響鮮切蘋果品質的重要因素之一。鮮切蘋果處理后褐變度的變化如圖7所示，貯藏2～10 d，處理組鮮切蘋果褐變度顯著低于對照組（P＜0.05）。隨貯藏時間的延長，處理組褐變度略有增加，在貯藏第4 d和6 d，褐變度無顯著性變化（P＞0.05），而對照組褐變度顯著增加（P＜0.05）。這可能與復配保鮮劑對蘋果果實中活性氧的形成和相關氧化酶活性的抑制作用有關。

圖7 最佳復配保鮮劑對鮮切蘋果褐變度變化的影響Fig.7 The effect of the best compounding preservative agent on the degree of browning changes of fresh-cut apples

2.3.5 最佳復配保鮮劑對鮮切蘋果菌落總數的影響

由表5可知，第10 d時，CK對照組鮮切蘋果菌落總數達到106CFU/g，而處理組菌落總數仍低于106CFU/g，且CK組的蘋果表面菌落總數增長速度明顯快于處理組（P＜0.05）。結果表明，薄荷、丁香、殼聚糖復配保鮮劑處理鮮切蘋果可有效抑制蘋果表面微生物的生長。

表5 最佳復配保鮮劑對鮮切蘋果菌落總數的影響（×103 CFU/g）Table 5 The effect of the best compounding preservative agent on the total number of bacteria of fresh-cut apples(×103 CFU/g)

2.3.6 最佳復配保鮮劑對鮮切蘋果感官品質的影響

如表6所示，抽選10人對薄荷、丁香、殼聚糖復配保鮮劑處理過的鮮切蘋果進行感官評定，取平均值作為結果。處理組浸泡過的鮮切蘋果的色澤、氣味和質感分值隨貯藏時間延長呈逐漸下降趨勢。對照組第2 d開始感官評分顯著低于處理組（P＜0.05），且對照組蘋果在貯藏的第6 d出現明顯褐斑，到第8 d發生腐敗，處理組則在第10 d才產生少量褐斑且未發生腐爛，相比對照組，處理組蘋果貨架期延長了4～5 d，證實本實驗復配劑對鮮切蘋果有一定的保鮮作用。

表6 最佳復配保鮮劑對鮮切蘋果感官品質評定結果Table 6 The sensory quality evaluation results of the best compounding preservative agent on fresh-cut apples

3 結論

本實驗以蘋果腐爛病菌為供試病菌通過單因素和響應面試驗確定了薄荷提取物、丁香提取物與殼聚糖復配保鮮劑的最佳配比，并將最佳復配條件下制備的保鮮劑對鮮切蘋果浸泡處理以探究其保鮮效果。發現薄荷提取物、丁香提取物、殼聚糖含量添加量分別為2%、3%、1.5%時對蘋果腐爛病菌的抑制率可達95.03%。保鮮結果顯示，復配保鮮劑與對照組相比在不同程度上可顯著延遲蘋果腐爛的速度、抑制蘋果失重率的上升、延緩抗壞血酸、還原糖、可滴定酸及可溶性固形物的降解，抑制微生物菌落的生長，能夠較好的維持鮮切蘋果的感官品質。本研究進一步證實了薄荷、丁香提取物和殼聚糖對鮮切果蔬的保鮮作用，此外，蘋果作為切制后極易氧化褐變的蔬果，其自身水分流失程度、脆度、氧化褐變、表面菌數、貯藏環境等均會影響其貨架期的延長[32]，本研究后期還需對其貨架期進行精準預測，為鮮切水果的保鮮研究提供進一步的參考。