微波法制備獼猴桃生物質碳點及應用于金銀花中Fe3+的檢測

趙鴻賓，冷天翠，劉曉夢，姜艷萍，李春榮，孟鐵宏, ，胡先運,3,

（1.黔南民族醫學高等專科學校藥學系，貴州都勻 558000；2.貴州醫科大學第三附屬醫院藥房，貴州都勻 558000；3.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550002）

碳點（Carbon Dots，CDs）是以碳為骨架結構的新型納米材料，是一種分散的粒徑小于10 nm的類球形納米顆粒[1]。CDs既具有優良的熒光特性和水溶性，又具有生物相容性好[2]、化學穩定性高[3]、耐光漂白性強[4]等優點，被廣泛應用于光電[5]、安全與識別[6]、離子及藥物分子檢測[7-11]、熒光傳感[12]、細胞成像[13-14]等領域。

CDs的合成方法主要歸納為“自上而下（Topdown）”和“自下而上（Bottom-up）”兩種方法[15]。自上而下法是通過氧化物切割碳而獲得如碳棒、碳纖維、碳納米管等材料。自下而上合成法則是具有-OH、-COOH、-C=O和-NH2等基團的小分子、聚合物在高溫下脫水并進一步碳化制備熒光碳點。自上而下的合成方法通常有電弧放電法[16]、激光燒蝕法[17]、電化學法[18]。自下而上的合成方法通常有：溶劑熱合成法[19]、燃燒法[20]、熱解法[21-22]和微波合成法[23]等。其中，微波法制備CDs的操作簡單，周期短，產率高，能耗低，是快速制備CDs的首選方法[24]。生物質資源因具有來源豐富、分布廣泛、取材簡單、成本低廉、毒性小[25]等優點，是制備CDs的理想碳源。利用生物質制備的CDs熒光性能強，安全性高，易于功能化，因此生物質CDs具有更廣闊的應用空間[26-27]。目前，以果蔬為碳源合成CDs的研究已有諸多報道，楊克琴[28]以胡蘿卜為生物質碳源，采用水熱法合成熒光生物質碳點，并成功應用于人膀胱癌活細胞熒光成像。穆海峰等[29]以紫甘藍為原料，硼氫化鈉為還原劑，采用水熱合成法制備了碳量子點。獼猴桃為常見水果，原料易得，果肉多汁，富含糖類、維生素、氨基酸等多種有機物，是合成CDs的優質碳源。

本文擬以獼猴桃為生物質碳源，乙二胺為表面修飾劑，通過正交試驗優化微波法制備氮摻雜CDs的參數。初步探討Fe3+對獼猴桃生物質CDs熒光猝滅作用，嘗試建立一種測定金銀花等中藥材中鐵含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃 購于都勻市水果超市，經王傳明副教授鑒定為美味獼猴桃品種；金銀花 購于都勻市湘君大藥房；乙二胺、硫酸奎寧、醋酸、醋酸鈉及其它無機化學試劑 均為分析純；實驗用水 為雙蒸水。

JEM-2100透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；icAN9型傅立葉紅外光譜儀 天津市能譜科技有限公司；F-7000熒光光譜儀 日本日立公司；Cary 100型雙光束紫外可見光譜儀 北京安捷倫公司；S-2F型pH計 上海雷磁儀器公司；XT-9912型微波消解儀 上海新拓分析儀器科技有限公司；P70F23PG5（S0）型微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CDs制備單因素實驗

1.2.1.1 乙二胺用量 將新鮮獼猴桃去皮榨汁，經減壓過濾得獼猴桃汁約200 mL，置于2～6 ℃冰箱儲存備用。取一系列100 mL錐形瓶，依次加入1.0 mL獼猴桃汁（含干物質約0.13 g）和7.0 mL蒸餾水，再分別加入1、2、3、4、5、6 mL乙二胺，渦旋混勻后置于微波爐轉盤中，調節功率至560 W（中高火），加熱15 min。反應后取出放冷，加入適量蒸餾水溶解，轉移至一系列100 mL容量瓶中加水稀釋并定容。取適量溶液離心15 min（4000 r/min），取上清液經0.22 μm濾膜過濾。精密量取濾液1.0 mL稀釋定容至100 mL，靜置15 min，在365 nm激發光下檢測其熒光強度。

1.2.1.2 加熱時間 取一系列100 mL錐形瓶，依次加入1.0 mL獼猴桃汁、1.0 mL乙二胺和7.0 mL蒸餾水，渦旋混勻后置于微波爐轉盤中，調節功率至560 W，逐一加熱，時間分別為5、10、15、20、25、30 min。反應后取出放冷，并按1.2.1.1項下方法進行稀釋、離心、過濾等處理，檢測其熒光強度。

1.2.1.3 加熱功率 取一系列100 mL錐形瓶，依次加入1.0 mL獼猴桃汁、1.0 mL乙二胺和7.0 mL蒸餾水，渦旋混勻后逐一放入微波爐轉盤中，分別調節功率為125 W（低火）、260 W（解凍）、400 W（中火）、560 W（中高火）、700 W（高火），加熱15 min。反應后取出放冷，并按1.2.1.1項下方法進行稀釋、離心、過濾等處理，檢測其熒光強度。

1.2.1.4 加水量 取5個100 mL錐形瓶，依次加入1.0 mL獼猴桃汁和1.0 mL乙二胺，再分別加入3、5、7、10、15 mL蒸餾水，按照1.2.1.1項下方法加熱反應，并進行后續處理，檢測其熒光強度。

1.2.2 正交試驗設計 通過對單因素實驗結果的直觀分析，分別確定乙二胺用量、微波加熱時間、加熱功率、加水量等4個因素及其3個水平（如表1所示）。按照L9（34）正交試驗設計完成CDs的制備，測定其熒光強度，并利用分析軟件進行數據處理。根據正交試驗優化的最佳制備條件制備獼猴桃碳點，加入適量蒸餾水溶解，稀釋成100 mL CDs儲備液。取20 mL CDs儲備液，離心15 min（4000 r/min），取上清液經0.22 μm濾膜過濾，濾液透析12 h，減壓濃縮，干燥，得53.9 mg獼猴桃碳點。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.3 CDs結構表征 將制備的CDs按要求進行減壓干燥處理，采用JEM- 2100 透射電子顯微鏡觀察碳量子點形貌粒徑；采用icAN9傅里葉變換紅外光譜儀測定樣品的紅外光譜圖，分辨率為4 cm-1，波數400～4000 cm-1；采用F-7000熒光光譜儀測定熒光發射光譜；使用Cary100型雙光束紫外可見分光光度計測定樣品的紫外-可見吸收光譜。

1.2.4 熒光量子產率測定 將硫酸奎寧溶于濃度為0.1 mol/L的硫酸中，制得硫酸奎寧溶液（Φs=54.0%，365 nm），作為標準參照物。在365 nm波長下，分別測定一定濃度的獼猴桃碳點溶液和硫酸奎寧溶液的紫外吸光度及熒光發射峰積分面積，并在室溫條件下測定其的折光率。根據公式（1）計算熒光量子產率[30]：

式中，Φ：熒光量子產率（%）；I：熒光發射峰積分面積（a.u.）；A：激發波長處溶液的吸光度；η：溶劑的折射率（%）；s：硫酸奎寧標準物；x：獼猴桃生物質碳點溶液。

1.2.5 Fe3+檢測條件的優化

1.2.5.1 放置時間 精密稱取1.2.2項下CDs適量，加蒸餾水配制成2.7 μg/mL的CDs溶液。取CDs溶液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入0.01 mol/L的FeCl3溶液1.0 mL，分別于5、10、15、20、30、45 min測其熒光強度，考察CDs與Fe3+放置時間。

1.2.5.2 緩沖溶液pH 取一系列10 mL容量瓶，依次加入1.2.4.1項下CDs溶液1.0 mL、0.01 mol/L的FeCl3溶液1.0 mL，再分別加入pH4.2、4.6、5.0、6.0的HAc-NaAc緩沖溶液1.0 mL，加去離子水稀釋至刻度，充分混合后靜置30 min，檢測熒光強度，比較在不同pH的HAc-NaAc緩沖溶液中，Fe3+對CDs溶液熒光猝滅程度。

1.2.6 CDs應用于Fe3+的檢測 依據1.2.4項下優化條件，在一系列10 mL容量瓶中，加入1.2.4.1項下濃度為2.7 μg/mL的CDs溶液1.0 mL、HAc-NaAc緩沖溶液（pH4.6）1.0 mL和不同體積的0.01 mol/L FeCl3溶液，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，測定熒光強度，考察Fe3+檢測的線性范圍。

另取一系列10 mL容量瓶，分別加入CDs溶液1.0 mL、HAc-NaAc緩沖溶液（pH4.6）1.0 mL和0.01 mol/L不同離子的鹽溶液1.0 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，空白試驗平行操作，檢測其熒光強度，考察該檢測方法的選擇性。

1.2.7 金銀花樣品的處理及其Fe3+的檢測

1.2.7.1 金銀花樣品前處理 精密稱取金銀花粉末0.1 g，置于聚四氟乙烯消解罐中，先加入4 mL濃硝酸，放置30 min，再加入2 mL H2O2，加蓋放入微波消解儀中按表2程序消解。待消解完成將消解罐置于90 ℃電熱板上加熱，將酸趕盡，冷卻后收集于100 mL容量瓶中，并用超純水定容至刻度，即得金銀花供試品溶液，置于2～5 ℃冰箱中保存備用。

表2 微波消解程序Table 2 Program of microwave digestion

1.2.7.2 金銀花樣品中Fe3+的檢測 在10 mL容量瓶中，加入1.2.4.1項下同濃度的CDs溶液1.0 mL、HAc-NaAc緩沖溶液（pH4.6） 1.0 mL和1.0 mL金銀花供試品溶液，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，測定熒光強度（F/F0），代入標準曲線方程計算出金銀花供試品溶液中Fe3+的含量，并通過回收率試驗考察該檢測方法的準確度。

1.3 數據處理

CDs制備單因素實驗數據及Fe3+檢測試驗數據采用Origin 2018 軟件作圖，正交試驗及離子選擇性數據分析采用SPSS 18.0軟件處理。

2 結果與分析

2.1 CDs制備單因素實驗

結合文獻報道[31]，氮摻雜CDs常采用尿素、硫脲、乙二胺、乙二胺四乙酸等含氮化合物作為表面修飾劑，通過化學反應，生成富含羧基和酰胺基等親水性官能團的藍色或藍綠色熒光碳點。在CDs的合成中，首先考察了上述4種表面修飾劑對CDs合成的影響。試驗數據表明，以乙二胺為表面修飾劑合成的CDs熒光最強，故后續實驗均以乙二胺為表面修飾劑合成碳點。當乙二胺的加入體積為2 mL時，碳點的熒光較強，隨著體積的增大反而下降，究其原因可能是因為乙二胺過量，在加熱時揮發導致反應溶液溫度降低，從而影響CDs的合成。

加熱功率和時間均對CDs的合成有一定的影響。微波加熱的功率會直接影響反應體系的溫度，當功率為125 W，反應15 min時，反應混合物仍為液體。當功率調為300 W以上時，反應混合物為褐色固體，且在400 W時熒光最強。加熱時間在10 min以下時，由于維持高溫時間較短，合成CDs的熒光強度較低，當加熱15 min時，合成CDs的熒光強度較強。同時，反應混合液中水量增加也會影響反應的溫度，當微波加熱功率為560 W，加水5 mL時合成CDs的熒光最強，隨后呈逐漸下降趨勢。

通過對單因素實驗結果直觀分析，當猴桃汁取樣量為1 mL時，各單因素中最佳水平分別為：乙二胺加入量2 mL，加水5 mL，微波加熱功率400 W，加熱時間15 min。詳見圖1（a～d）。

圖1 乙二胺用量（a）、加熱時間（b）、加熱功率（c）、加水量（d）對CDs熒光強度的影響Fig.1 Effects of ethylenediamine dosage(a), heating time(b),heating power(c) and water content(d) on fluorescence intensity of CDs

2.2 正交試驗結果及方差分析

對正交試驗數據（表3）進行方差分析，結果（見表4）表明：在制備獼猴桃碳點的條件中，微波加熱功率對CDs合成有極顯著性影響（P＜0.01），其他因素均無顯著性影響（P＞0.05），其影響程度大小依次為：C＞B＞A＞D，即微波加熱功率＞加熱時間＞乙二胺用量＞加水量，結合直觀分析，確定最佳的制備條件為：微波加熱功率560 W，加熱時間20 min，乙二胺用量2 mL，加水量5 mL。

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結果Table 4 Analysis of variance

2.3 CDs結構表征

為了解制備的CDs組成及表面基團，對其進行透射電子顯微鏡及紅外光譜表征，圖2 （a） 為CDs的TEM，從圖2 （a）中可以看出，制備的CDs呈形狀均一、大小均勻、在水中分散性良好，其平均粒徑約為2.5 nm。圖2 （b）為CDs的FT-IR，從圖2 （b）中可以看出，在3367 cm-1處的特征吸收峰為-OH或-NH-等活潑氫的伸縮振動吸收峰，2833 cm-1處的特征吸收峰為-OCH3中的C-H伸縮振動吸收峰，2946 cm-1處的特征吸收峰為C-H伸縮振動吸收峰，1030 cm-1處的吸收峰為C-O伸縮振動吸收峰。紅外光譜數據表明CDs的表面含有-OH、-NH-、C-O等基團。

圖2 CDs 的TEM圖（a）和FT-IR光譜圖 （b）Fig.2 TEM image （a） and FT-IR spectrum （b） of CDs

CDs水溶液在日光下呈微黃色，在紫外燈照射下，發射藍色熒光。對CDs進行紫外-可見吸收光譜及熒光光譜性能測試，紫外吸收圖如圖3（a）所示，在約256～300 nm范圍內有紫外吸收帶，該吸收帶主要是CDs sp2區域中π-π* 躍遷[32]。在365 nm波長紫外光的激發下，其發射峰波長為452 nm，半峰寬約為110 nm，溶液如圖3（b）所示。采用硫酸奎寧（其量子產率為54.0%）作為標準參照物，為了使再吸收效應最小化，所測溶液的吸光度值均應小于0.05，測得CDs的熒光量子產率為5.6%。

圖3 CDs的紫外-可見吸收光譜圖（a）和熒光發射光譜圖（b）Fig.3 UV-vis absorption spectrum（a） , fluorescene emission spectrum （b）

2.4 Fe3+的檢測條件的優化

如圖4所示，CDs水溶液在放置5～20 min時，熒光強度呈下降趨勢，20～45 min，熒光強度減弱趨緩。在pH4.2～5.5的HAc-NaAc緩沖溶液中，CDs的熒光強度隨著pH的增大逐漸減弱，當HAc-NaAc緩沖溶液pH4.6時，Fe3+對CDs的熒光猝滅效果最佳。結合相關文獻[33]，為了排除溶液pH對CDs熒光強度的影響，故選擇在pH4.6的HAc-NaAc緩沖溶液中考察Fe3+對CDs熒光強度的影響。

圖4 放置時間影響 （a）及pH影響 （b）Fig.4 Effect of storage time(a) and pH(b)

2.5 CDs應用于Fe3+的檢測

為進一步考察Fe3+對CDs熒光猝滅的動力學特征，研究Fe3+溶液濃度的變化對CDs熒光猝滅的影響，如圖5（a）所示，隨著Fe3+濃度的增加，CDs熒光強度逐漸減弱。當Fe3+的加入量在0.2～10 μmol/L范圍內，CDs的熒光猝滅程度（F/F0）隨Fe3+濃度的增加而呈線性下降，如圖5（b）所示，其線性方程為Y=-0.05312c+1.01882（R2=0.9934），線性關系良好，檢出限（S/N=3）為0.12 μmol/L。

圖5 CDs隨Fe3+濃度（0～10 μmol/L）變化的熒光光譜圖（a）及CDs的熒光猝滅程度與Fe3+濃度（0.2～10 μmol/L）之間的關系曲線（b）Fig.5 Fluorescence spectra of CDs with Fe3+ (0～10 μmol/L)(a) and the curves of CDs fluorescence quenching with Fe3+(0.2～10 μmol/L)(b)

2.6 CDs對Fe3+的選擇性

為研究CDs應用于Fe3+檢測的選擇性，在相同的濃度下，取Fe3+、Cr3+、Co2+、Ni2+、Sn2+、Zn2+、Ba2+、Fe2+、K+、Al3+、Na+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ag+、Pb2+等16種常見金屬離子進行試驗，并進行單因素方差分析。所得試驗數據均滿足方差齊性要求，單因素方差分析結果表明Fe3+組與空白組及其它離子組之間差異明顯，說明Fe3+對CDs 熒光猝滅作用明顯，CDs應用于Fe3+的檢測有較好的選擇性。除Fe3+組以外的其他金屬離子與空白組之間無明顯差異，結果如圖6所示。

圖6 CDs 對金屬離子的選擇性Fig.6 Selectivity of ions as using CDs probes

2.7 金銀花樣品中的Fe3+的檢測

基于Fe3+對CDs熒光猝滅作用，試驗采用熒光光度法[34]測定金銀花樣品中的Fe3+。為了驗證該方法的準確度，試驗選用常用中藥材金銀花為檢測對象，設計加標回收試驗，結果如表5。其加標回收率在98.82%～103.20%之間，相對標準偏差（RSD）介于1.67%～2.05%之間，符合中國藥典[35]方法學考察要求。表6為不同方法檢測金銀花中Fe3+的結果。其中，本文采用的熒光光度法檢出限較原子光譜法低，線性范圍也相對較小，這表明該方法適合微量Fe3+的檢測。

表5 金銀花Fe3+的檢測與加樣回收率（n=3）Table 5 Determination results and recovery of Fe3+ in honeysuckle (n=3)

表6 與其他檢測Fe3+的方法比較Table 6 Comparison with other methods for determination of Fe3+

3 結論

近年來，利用天然產物合成碳點，因其綠色環保、無毒無害，成為熒光探針研究的熱點。本文以獼猴桃為生物質碳源，乙二胺為表面修飾劑，采用微波法一步合成了具有功能化的獼猴桃生物質碳點，通過正交試驗優化了制備工藝參數，其最佳參數為微波加熱功率560 W，加熱時間20 min，乙二胺用量2 mL，加水量5 mL。該參數穩定可靠，較水熱法[39]合成CDs時間短，操作簡便。

基于CDs熒光強度隨加入Fe3+濃度的增大而呈線性減弱，進而建立一種檢測鐵離子的方法。本文方法相對原子光譜法，檢測限低，線性關系良好，符合方法學考察要求，是一種具有選擇性好、檢測成本低、快速靈敏的Fe3+檢測方法，可用于中藥材中微量鐵的檢測。